Gen injenerligi Reja: 1. Molekulyar biologiya genetik injeneriyaning poydevori. 2.Rekombinat DNK loyihallashtirish 3. Soxta tomonini tikish (DNK). 4. O`tmas tomoni bilan tikish (DNK). 5. O`simliklarning gen injeneriyasi. 6. O`simliklarning gen injeneriyasi. Molekulyar biologiya genetik injeneriyaning poydevori. Vokiyliklarni jadal rivojlanishi XX asrga xos bulib, ana shu rivojlanish ilmiy progresga xosdir. Kiska muddatda ikkita yangi texnologiya yuzaga keldi, ya’ni yadro texnologiyasi va elektronika. Uchinchisi- biotexnologiya bulib uning asosini biologik revolyusiya tashkil etadi. Biotexnologiyani muxim kismini genetik injeneriya tashkil etadi. Genlar injeneriyasi yakin kelajakda irsiy kasalliklarni rak, spid va boshqa kasalliklarni davolash xam gen injeneriyasining zimmasiga yuklatilgan. Genetik injeneriyani kishlok xo`jaligi va halq xo`jaligining boshqa sohalarida kullanilishi natijasida juda ulkan galabalarga erishilmokda. Ayniksa, odam va xayvonlar uchun sun’iy oqsil, organik moddalarni utillizasiyalash, chikitsiz texnologiya, biologik gaz olish, maxsuldor chorva mollari yaratish, yangi o`simliklar navlarini yaratish, kasallik, gerbisid, xashoratlar va boshqa salbiy ta’sirotlarga chidamli navlar yaratish biotexnologiya usulida amalga oshirilmokda. Yakin un yillar ichida biotexnologiya yuli bilan erishiladigan galabalarni tasavvur kilib bulmaydigan darajada deb xisoblashga tulik asoslar bor. DNK fragmentlarini klonirlash genetik injeneriyani asosidir. Genetik injeneriyani akademik A. A. Bayev «Funksional aktiv genetik strukturani loyihallash yoki sun’iy genetik strukturani loyillash yoki sun’iy genetik programmasini» tuzish deb atagan. Ushbu aniklashning ma’nosi xam molekulyar genetik tizimni organizmdan tashkarida o`stirish va yana organizmga kiritishdan iboratdir. Amaliy genetik injeneriyani asosiy vazifasi rekombinasion DNK molekulasi organizmga kirganidan ke keyin insoniyat uchun foydali bulsin. Ana shu vazifani amalga oshirish uchun DNK molekulasidan foydali kismini ajratib olib, uni o`stirib kupaytirib undan foydalanish lozim bo`ladi. Ana shunday rekombinant DNK dan RNK molekulasini sintez kilish mumkin, keyin RNK oqsil sintez kilinadi. Ana shu ishlarni amalga oshirish DNK rekombinant texnologiyasi buyicha genlarni klonirlash biologiya barcha kurinishni tubdan o`zgartirdi. Genetik injeneriyani yuzaga kelishi molekulyar biologiyani rivojlanishi bilan boglik. Oxirgi yillarda kimyoviy va enzimologik uslubiyatni rivojlanishi DNK rekombinasiyasini yaratishga yordam berdi va biotexnologiyani asosiy kismi bulgan genetik injeneriyaga asos solindi. 10.1.2. Restriktazalar. Restriksion endonukleaza- restriktaza ferrmenti DNK ketma-ket parchalanishiga olib keladi. Ushbu ferment DNK anik kismini bir tekisda parchalaydi. Bakteriyalar uz DNK xar xilda kuzatadi, restriktaza esa uzining vazifasini xar xildagi ketma-ketlikda bilib turadi. Hozirgi vaqtda DNK parchalanishini 150 turini restriktaza boshqaradi. Restriktazalar kichik va katta bo`ladi. Birinchi bulib tetranukleotidni biladi. 10.1.3. Restriksion xarita tuzish. Restriktazalar DNK xar xilda parchalaydi. Parchalanish natijasida bir ipli uzunligi 4 nukleotiddan iborat. Ana shu fragmentlar rekombinat DNK xosil kilish uchun juda kulay. Hozirgi vaqtda restriksion fermentlar tekshirish ishlarining samarali kuroli bulib koldi. Ushbu ferment DNK molekulasini juda kattalikkacha bir necha yuztadan, bir necha mingtagacha aosgacha oshirilishi imkoniyatini yaratadi. Eletrofarez yordamida DNK fragmentlarini juda osonlik bilan ajratib olinib xar bir fragmenti aloxida urganish mumkin. Elektrofarezda ajratib olingan DNK anion shaklida bo`ladi. DNK molekulasi kancha uzun bulsa, uning zaryadlari shunchalik kup bulib va kuchli bo`ladi, xamda karshilik kursatish kuchi xam shunchalik yukori bo`ladi. DNK kiska fragmentlari migrasiyasi, uzun fragmentlarnikiga nisbatan ancha tez bo`ladi. Agarda ozika muxiti agarning konsentrasiyasi juda yukori bulsa uzun fragmentli DNK umuman erritmaga yaxshi aralasha olmasligi mumkin. Restriksion fragmentlarni elektrofarez yuli bilan ajratganda restriksion xaritalar olish imkoniyati tugiladi. Ana shunday birinchi xarita SM virusidan olingan. (maymun virusi) bulib unda 5423 juft asos bulgan. Keyin restriksion xarita va fragmentlar DNK uchastkalarini xaritalashtirishda foydalanilgan, unda oqsil viruslari uchun mRNK sintez bo`ladi. 10.1.4.Nukleotidli ketma-ketlikni aniklash. DNK genetik muxim kismini ifodalovchi usullar juda katta axamiyatga ega bulgan. Ana shu usullar DNK rekombinat molekulalarini xosil kilishda xam muxim axamiyatga ega bulgan. Ushbu yangi usullar nukleotidlar juftlarini 100-500 uzunliklarini aniklashga yordam bergan. Ana shunday usullardan biri 1977 yilda Mans va Gilbertlar tomonidan taklif etilgan DNK kimyoviy degradasiyasidir. Ushbu usul buyicha DNK fragmentlarini bironta kismiga fosfor (32r) izotopi ta’sir etdiriladi, natijada DNK turtta kismga bulinib, ana shu turtala asosning bittasi yoki ikkitasi molekulani buzish xususiyatiga ega bo`ladi. Reaksiya sharoiti shunday tanlanadiki xar bir DNK molekulasiga bir nechta buzilish tugri kelsin. DNK ning buzilganidan sung elektrofarez yordamida ajratiladi, radiaktiv fragmentlari bulganlari rentgen plenkasida belgilanadi. Rentgen t plenkadagi polosalar vositasida nukleotidlardagi DNK ketma- ketligi aniklanadi. Ana shu usulda SM 40 DNK nukleotidlar ketma-ketligi tuligicha aniklandi. 10.2. Rekombinat DNK loyihallashtirish. Rekombinat DNK deb, probirkadagi (yoki in vitro-tashkarridagi) xar xil biologik manbalardan ajratilgan ikkita yoki ko`proq DNK fragmentlari tushuniladi. Ana shu aniklikning asosiy kaliti «DNK fragmenti» va (probirkadagi) muxit xisoblanadi. Restriktaza fermenti yordamida DNK fragmentlarini bir-birisi bilan oson kushiladigan va kiyin kushiladigan uchlari bilan olish mumkin. DNK fragmentlarini kaysi uchlarini kushilishiga karab, DNK kushishni ( bir- biriga tikish ) uch xil usuli mavjud ya’ni, soxta tomoni bilan tikish; utmas tomoni bilan tikish va xio xil tomoni soxta tomoni bilan tikish. 10.2.1. DNK soxta tomoni bilan tikish (biriktirish). Ayrim restriktazalar DNK zanjiriga mos keladi, markaziga nisbatan teng masofada bo`ladi. Ana shu kismlar asoslari bilan kushilishga moyil bo`ladi, shuning uchun uni komplementar yoki soxta tomonli deb ataladi. Asoslarini kushilishi soxta tomonlarini birlashishi natijasida sodir bo`ladi. Restriktaza ta’sirida xosil bulgan xar ikkala fragment bir ipli komplementar nukleotidlarni vodorod birikmasini kushilishi natijasiga xosil bo`ladi. Ana shunday kushilish natijasida kushalok zanjir tiklanmaydi. Uning tiklanishi uchun DNK-ligaza fermenti ishlatiladi. Ushbu ferment xam restriktazadan funksiyani DNK fragmentlarini kushilishidagi funksiyani bajaradi. Lekinda Ligaza DNK ni rekombinasion xosil bulishini oxiriga yetkazadi. Ana shunday dastlabki tajriba Amerikaning Berg shaxrida restriktazadan foydalanib, uni DNK-ligaza bilan birgalikda umumiy rekombinasiya usulini xosil kilishga xizmat kiladigan usul bulishi aniklangan. 10.2.2. DNK ni utmas tomoni bilan tikish. DNK fragmentlarini utmas tomonlari bilan tikish yoki birlashtirish juda muxim. Utmas tomonlari xam Ligaza fermentlarini yukori konsentrasiyasi katnashsa birlashish osonlashadi. Birok DNK fragmentlarini utmas tomonini soxta tomoni bilan xam birlashtirish mumkin. 10.2.3. Xar xil nomli soxta tomonlari bilan birlashtirish (DNK ni) Xar xil endonukleazalar xosil bulganda komplektar bulmagan (bir-biriga tugri kemagan) soxta tomon fragmentlarni birlashtirishda Linkerlar yoki utuvchilar kullaniladi. Linkerlar-kimyoviy sintez bulgan oligenukleotidlardir. Linkerlarni utkir va utmas tomonlari bo`ladi. Agarda zaruriyat tugilsa, utmas tomonini xam utkirlab fragmentlarni oson birlashadigan xolatga aylantirish mumkin. Buni endonukleaza Se fermenti vositasida amalga oshirish mumkin. Ushbu ferment faqat bir zanjirli DNK buzadi. DNK tikilganidan sung uni tirik xajayraga kiritish mumkin, birok darrov vektor yuzaga keladi. Vektor molekulalar (DNK da) Transformasiya. Genetik injeneriyani asosiy ishi rekombinasion DNK molekulasini saklab kolgan xolda hujayraga genetik informasiya (ma’lumot) kiritish xisoblanadi. Unga vektor molekulalar yordamida erishish mumkin. Agarda DNK oddiy usulda kiritilsa nukleotidlarga fermentlar xujumi boshlanadi. Hujayrani genetik apparatini asosiy kismi bulishi uchun rekombinasion DNK genlarning xromosomlari bilan kushilishi kerak. Vektorlar hujayralarga kushimcha genetik ma’lumotlarni kirishiga yordam beradi. Viktorlar (tezlatuvchi) sifatida plazma, bakteriofaglar, mobil (oson birlashuvchi) elementlar va xayvonlar viruslari bulishi mumkin. 10.2.5. Klonirlash uchun bakterial plazmalar. Bakteriyalarning hujayra DNK asosiy kismi xromosomlarda bo`ladi. Masalan: bakteriyalarda Ye. Sole da 4 million juft nukleotidlar xromosomalarda bo`ladi. Bakteriyalar xromosomlarida juda mayda bir necha ming juft aylana shaklidagi ( shar shaklida) DNK molekulalari xam bo`ladi. Ana shunday mayda xromosomalar plazmidlar deyiladi. Plazmidlar uz tarkibida genetik jixatdan chidamli antibiotiklarga ega bo`ladi. Ana shu genlar xromosomalarda emas plazmidlarda bo`ladi. Plazmidlarda kalsiy (Sa) bulsa bakteriyalarda oson uzlashtiriladi. Plazmidlar kuchsiz nazoratda bulib, ularni kopiyalari 10-200 gacha bulguncha kupayadi. 10.2.6. Genlar kitubxonasi. Xromosomalar genlarini ajratish maksadida parchalash usulini kullanilishi genlar kitobxonasini ( klonoteka) tashkil kilinishiga yordam beradi. Ana shu usuldagi tekshirishlar eukariotlar genini 10 ming donagacha nukleotidlar va oqsillar juftlari egallashini isbotladi. Genlar kutubxonasini tashkil etishda begona DNK nukleotidlari asosiy rol uynaydi. Bakteriofaglar asosida vektorlar loyihallashtirilgan, ularni uzunligi 20 ming DNK fragmentlaridan iborat. Begona DNK fragmentlarini olish uchun DNK xromosomalari yukori polimerli fermentlar bilan fermentlashtiriladi, bunday fermentlarga restriktaza kiradi. Restriktaza fermenti yordamida DNK ishlashda shunday rejim yuklanadiki olingan fragmentlarni kattaligi vektorlar xajmiga tugri kelsin. Yanada uzunrok genlar ajratish uchun yanada uzunrok DNK fragmentlarini plonirlash kerak. 10.2.7. Genlarni ajratish. Genlarni ajratib olish genetik injeneriyaning bosh etaplaridan biri xisoblanadi. Genlarni ajratib olishni ikkita yuli bor: Genlar sintez kilinadi, yoki rekombinat DNK dan keraklisi ajratilib olinadi. Komplektar DNK sintez kilishda transkriptaza yoki revertaza fermenti katta rol uynaydi. Ushbu ferment ayrim tarkibida RNK bulgan onkogen viruslardan ajratilib olingan. Ferment RNK molekulasida DNK komplektar zanjiri sintez bo`ladi. Bizga kerak bulgan genni olganligimizga ishonch xosil kilish uchun bir nechta usullar mavjud. Agarda oqsil aminokislotasining ketma-ketligi anik bulsa, ma’lum oqsilni joylashgan joyiga karab aniklash mumkin. Ayrim xollarda kaysi genni olganligimizni aniklash uchun DNK-RNK duragaylash usuli kullaniladi. Ushbu xolat kachonki mRNK ajratilib olingan bulgandagina kuzatiladi. Ushbu usulda k DNK denaturasiyaga uchrab DNK ishlari bir-biridan ajraladi, kushalok spiral yuzaga kelib DNK-RNK molekulasining duragayi xosil bo`ladi. Agarda kDNK molekulasida mRNK ni sintez bulganligini, keyin oqsil xar xil bulganligini immunokimyoviy usulda oqsilni aniklash yuli bilan aniklash mumkin. Ana shu usullar kaysi genni ajratib olganligimizni aniklab olishga yordam beradi. 10.3. Genlar ekspressiyasi va sut emizuvchilarga genni kiritish. Kupchilik bakterial genlar shunday tashkil topganki, ular xar xildagi samaradorlik bilan mavjud. Masalan E. Coli oqsil mikdori 0,1% dan 2% gacha bo`ladi. Genlarni aktivlik darajasi RNK-polimeraza vositasida sintez bo`ladigan mRNK mikdoriga boglik. DNizchilligida RNK- polimerazalar izchil boshqaruvchilar xisoblanadi. Ana shunday izchillik DNK molekulasini ma’lum kismida RNK-polimeraza bilan boglangan xolda motor vazifasini bajaradi. E. Coli dagi boshqaruv ishlari xam translyasiya darajasida bo`ladi. Genlardagi izchillikda nukleotidlar uzunligi 6-8 iborat bulib uning kodlari AUG iborat. Genlar ekspressiyasining izchilligi bitrinchi marta Shayna Dalcharno tomonidan aniklangan. Eukariot organizmlarda transkripsiya boshqaruvi juda murakkab. Eukariotlar hujayrasidagi genlarni propariotlar hujayrasiga kiritishda propariotlar hujayrasiga kiritishda propariotlar elementlari boshqarishi kerak. 10.3.1. Genlar ekspressiyasi. Rekombinat DNK loyihallashtirish uchun genlar ekspressiyasi kullaniladi (ekspressiya- tez va tuxtamaydigan). Buning uchun kuyidagi strategiya kullaniladi: DNK ning gen fragmentlari modifikasiyalanib-kodlanmaydigan kismi ajratiladi. Keyin oralik rekombinasion DNK loyihallashtiriladi, unga bakterial boshqaruvchi elementlar nazoratida gen joylashtirriladi. Ana shu boshqaruvchi elementlar maxsus ajratiladi. Birok, genlarni bakterial hujayra plazmasiga kiritish kulayrok. Ana shunday boshqaruvchi joyga genlarni - laktamazalarini kursatish mumkin. Genlarni -laktamazalarini boshqarish juda kiyin bulib undan foydalanish xar doim xam foyda beraolmaydi. Chunki ayrim azenlar bakteriyalarni o`sishiga tuskinlik kilishi mumkin. Ana shunday nokulayliklarni bartaraf etish uchun kelib chikishi begona bulgan oqsillardan foydalanish kulay. Ana shunday oqsilga pl isiklikka chidamli bir nechta bakteriofaglar genlariga javobgar oqsilni olish mumkin. Ana shunday oqsil-repressor 310 S aktiv bulib 380 S da aktivligi tuxtamaydi. Xarorat kutarilganda rl- repressorini aktivligi pasayib, kerakli oqsilni sintez bulishi oshadi. Ana shu oqsil mikdori 10% oshishi mumkin. Shunday kilib, bakteriyalar vositasida gen plazmalarini yukori maxsuldorligiga erishish mumkin. Ana shu xolat juda yukori iqtisodiy samara berishi mumkin. Xar xildagi prokariot va eukariot organizmlarda genno-injenerlik tajribalar utkazishda odamning ichagida yashovchi ichak Tayokchalari eng kulay muxit bulib xizmat kilmokda. Rekombinat DNK muvoffakiyatli texnologiyasida organizmlarda yaxshi urganilgan bakterial hujayralar Bfcillus Subtitis va Sachazomuces cezevisial xisoblanadi. B. Subtilis- patogen bulmagan tuprok mikroorganizmi bulib, faqat aerob sharoitda rivojlanadi. Basillalar toksinlar xosil kilmaydi, xayvonlar va o`simliklar uchun zararsiz. Shu bilan bir katorda E. Coli Lipolisaxarid endotoksin bulib uni ajratish kiyin. 20 xil xar xildagi basillalar hujayradan tashkarida 40 fermentlarni sintez kiladi. E. Coli esa oz mikdorda oqsilni sintez kilib uni ajratish va tozalash juda kiyin. Shu bilan bir katorda begona DNK ekspressiyasi (kushilishi) mavjud. Gaploid hujayralarda 17 xromosom mavjud, birok genlar juda oz, ya’ni, xammasi bulib 4 marta ortik, E. Coli nisbatan. 10.3.2. Sut emizuvchilar hujayrasiga begona gen kiritish. Sut emizuvchilar hujayrasiga begona gen kiritish uchun gen oldindan bakterial hujayraga o`stirilib, tugridan-tugri mikroorganizmga emas sut emizuvchi xayvonlar hujayrasiga kiritiladi. Ana xayvonlar hujayrasi oldindan ozika muxitida o`stirilgan bo`ladi. Xayvonlar hujayrasini aloxida o`stirish mikroorganizmlardagidan ancha kimmatga tushsada, sut emizuvchilarni oqsili ko`proq modifikasion xususiyatga ega. Ana t shunday oqsilni samarali rivojlanishi uchun unga shakar yoki lipoidlar zanjiridan kushilgan bulishi kerak. Ana shunday zanjirni xosil bulishi sut emizuvchilarning hujayralariga xos bulgan xususiyatdir. Lekinda bakterial hujayralarda bunday oqsil- shakar-lipoidlarning birgalikdagi zanjirini xosil bulishi kiyin. Sut emizuvchilar hujayralariga tozalangan DNK samarali kiritishda kalsiy (Sa) ionini kiritish muxim axamiyat kasb etadi. Agarda kalsiy kushilib DNK sut emizuvchilar hujayrasiga kiritilsa xromosomlar bilan bir tekisda birlashadi. Hozirgi vaqtda yana ikkita normal hujayrada ishlayoladigan universal gen pardalovchisi ( marker-pardalovchi ) ishlab chikilgan . Birinchisi o`stirilayotgan bakterial genlarni kodlashtiruvchi ksantin-guanin- fosforibozil transferaza (KGFRT) dan iborat kurilgan bo`ladi. Ikkinchisi propariot genlardan iborat bulib neomisin (NeO) Antibiotigiga chidamli SW 40 geniga birlashgan bo`ladi. Shunday kilib kotransformasii usulidan foydalanib xar kanday DNK plonirlangan segmentini eukariot hujayrasiga kiritish mumkin. Diametri 0,1-0,5 mikrop va mikromanipulyator mikropipetkalari urnatilgan pribor ixtiro etilganidan sung, begona DNK normal usib turgan organizm hujayrasining yadrosiga kiritish (mikroinyeksiya) imkoniyati yaratildi. Yaxshi jixozlangan uskunalar bilan 1 soatda 500-1000 hujayraga begona DNK kiritish mumkin. Ana shunday hujayralarning 50% kiritilgan genlar bilan xujayni hujayrani birlashishi kuzatilgan. Bu usulda sut emizuvchilardan viruslarga karshi antigen vaksinalari olishda keng foydalanish mumkin va odamlarni ayrim virusli xavfli kasalliklarini davolash imkoniyatlari yaratiladi. Hozirgi vaqtda genlarni embrionlar hujayralariga xam kiritilib ilmiy ishlar olib borilmokda. Buning natijasida hujayralarda yangi sifat o`zgarishlar yuzaga keladi. Chunki, organizmlarni ayrim hujayralariga yangi gen kiritilsa ayrim belgilarida o`zgarish sodir bo`ladi. Agarda embrional hujayraga yangi gen kiritilsa, o`zgarish butun organizmda sodir bo`ladi. Hozirgi vaqtda sut emizuvchilar, chivin va ayrim o`simliklarning embrional hujayralariga gen kiritish ishlab chikilgan. Hozirgi vaqtda sichkon embrioniga gen kiritish usuli yaxshi ishlab chikilgan. Genni embrional hujayraga kiritishda endigina atalanish sodir bulgan tuxum hujayrasi olinadi. Aloxida olingan gen kiritilgan tuxum hujayrasi sut emizuvchi xayvonning matkasiga kiritiladi. Ana shunday usulda matkaga joylashtirilgan tuxum hujayralarini 40% gacha tirik kolgan, samaradorligi esa hozirgi vaqtda urtacha 10% tashkil etadi. Begona DNK kiritilganidan sung vegetativ organlar va jinsiy hujayralardan topilgan. Birok hozirgi vaqtda embrional hujayralarga gen kiritishning samaradorligi juda past. Chunki, xar doim xam begona DNK xromosomni belgilangan joyiga joylashtirish kiyin. Xar doim xam yangi gen organizmni boshqarish imkoniyatini yaratmayapti. Ana shu kiyinchilikni yingish okibatida odamdagi 2000 xil genetik kasallikni davolash imkoniyati tugiladi. Xayvonlarni klonirlash ( probirkada o`stirish) da bitta hujayra yoki organizmni vegetativ usulda (jinssiz) yul bilan kupaytirish tushuniladi. O`simlikshunoslikda ayniksa ayrim daraxtlarni vegetativ kupayishi kiyin bulganda ularning biron-bir tukimasi olinib vegetativ usulda kupaytiriladi. Birinchi marta 1932 yilda kurbakani tuxum hujayrasidan yadrosini olib boshqasiga joylashtirishga erishilgan. Amaliy axamiyatga molik bulgan usul sut emizuvchilarni jinsiz yul bilan kupaytirish xisoblanadi. Buning uchun sut emizuvchilarni xamladorini embrional hujayrasidan olinadi. Mikropinetka yordamida yadrosi olinib boshqa sichkonning otalangan hujayrasiga joylashtiriladi. Keyin tuxum hujayrasidagi gen ajralib olinadi. 1981 yilda ana shunday kator tajribalar utkazilgan. Lekinda bunday tajribalar natijasini saradorligi past. Shu sababli ushbu tajribalar davom etmokda. DNKning rekombinant molekulalarini tuzishi usullari. Gen injeneriyasini in vitro sharoitda funksional genetik faol (rekombinant DNK) strukturalar tuzish deb aytish mumkin yoki sun’iy genetik programma yaratish deyish mumkin. Bizining adabiyotimizda "genetik injeneriya" va " Gen injeneneriya " suzlari qo’llanilib ular sinonim sifatida ishlatiladi. Gen injeneriyasi suzi kiska va qulay, faqat gen bilan boglik xollarda qo’llaniladi, "Genetik injeneriya " esa genetik dastur ma’nyusini (faqat gen emas) beradi. Genetik injeneriyaning paydo bo’lishi 1972 yilda Berg va uning xodimlari bo’rinchi marta rekombinant DNK yaratishlari bilan boshlanadi. Bu rekombinant DNK OV40 virusi va bakteriofag L DNK si dugal E. coli operoni galaktoza operonidan tuzilgan edi. Gen in jeneriyasi boshqa biologiya fanlar kabi bir nechta fanlar kushilishidan paydo bo’ldi. Lekin u molekulyar genetikaning to’g’ri avlodi ekanligi anik daliedir. Gen injeneriyasining shakllanishi genetik enzimologiya va nuklein kislotalar ximiyasining rivojlanishi bilan boglik. DNK tuzilishi yana ham chukur tushunish uchun nukleotidlar katorini - gen kismlarini, butun gen va butun xromosomani, aniklashning usullarini ishlab chiqish zarur edi. Nukleotidlar katori birinchi marta DNKda emas balki tRNKsining 75-80 nukleotiddan iborat kiska molekulalarida aniklandi. 1964 yilga kelib achitdi tRNKsining alaninli katori aniklandi. Bu ishni qilish uchun Rebert Xolli va uning xodimlari Kornelli universitetidan, shunday fermentlar olishdiki u tRNKsini tiklab bo’ladigan darajada kiska diskret fragmentlarga parchaladi va bu fragmentlarning tartibi oddiy pogonali degradasiya usuli bilan aniklandi. 1975 yilda Uolter Fors RNKli fag MS 2ning RNKsida nukleotidlar katorini anikladi. Birinchi marta oddiy xromosoma tuzilishi ma’lum bo’ldi. 3ta oqsil aminokislotalariga mas keladigan kodonlar aniklandi. Bu 3ta gen bir nechta aminokislotalar bilan ajratilgan bo’lib RNK molekulasi oxirida translyasiyalanmaydigan 129 va 174ta (5' va 3' kismlarga mos) nukleotidlar borligi aniklandi. Bu erda ham molekulaning fizik oxiri xech kachon inisiasiya yoki suzasiya signali bo’lib xizmat qilmaydi. 4.2. Restriksiyalovchi fermentlar DNKning spesifik tartibida uzilish hosil qiladi. Nuklein kislotalarining fosfodiefirli boglarini parchalovchi hamma nukleazalar ta’siri nukleotidlar katori tartibiga bogik emas edi. T1 RNKaza ancha spesifik bo’lib, faqat guanin qoldigi yakinidan uzilish beradi. 1953 yilda E.colining ma’lum shtammi DNKsi boshqa shtamm hujayrasiga kuritilsa u uz faolligini yo’qotishini va ancha mayda fragmentlarga parchalanishini kuzatadilar. Kamdan - kom xollarda yot DNK fragmentasiyalanimaydi, ya’ni qandaydir modifikasiyaga uchraydi va u DNK yangi bakteriya shtammida replikasiyalanadi. 1966 yilda virus DNKsi ximiyaviy analiz qilingandan keyin unda metilli asoslar borligi aniklandi. ModifisirlanmaganDNKda bunday metilli asoslar yo’q edi. Metilli asoslar DNKga tayyor xolda kirmaydi. U sintezlangan DNKga nukleotidlarining fermentativ metillanishi natijasida hosil bo’ladi. Styuart Mini, Verner Arber E.coli hujayralari ekstraktida V-spesifik modifikasiyalovchi ferment topdilar. Bu ferment DNKni metillashi va nukleazani restriksiyalovchi (restriktaza) bo’lib, metillanmagan DNKni parchalashi mumkin. Keyinchalik bir nechta saytspesifik nukleazalar topildi. Lekin bu T.coli ning restriksiyalovchi fermentlarining birortasi DNKning maxsus tartiblarini parchalaman edi. Ular DNKning tasadifiy nuktalaridan parchalar edi. Molekulyar manupulyasiya utkazish instrumenti bo’lib restriksiyalovchi endonukleaza va ligaza fermentlari xizmat qildi. Restriksiyalovchi endonukleazalar DNK fragmentlarini olishda, 2-chisi ligaza esa ularni biriktirishda zarurdir. Birinchi marta restriktaza 1968 yilda Mezel’son va Yuan tomonidan ajratib olinadi. 2chi gruppadagi restriktazalar esa 2 yildan keyin Smit tomonidan ajratib olindi. Keng tarkalgan restriktaza EcoR1 1971 yilda olinadi. Restriktaza ta’sirida hosil bo’lgan DNK fragmentlari gellarda elektroforetik ajratish usuli bilan har xil uzunlikdagi kismlarga ajratish mumkin. Shu asosda ximiyaviy toza material olish mumkin. 1967 yilda ochilgan masalan: T4-dezoksipolinukleatid ligaza, DNK fragmentlarini kovalent boglar bilan biriktirish mumkin. Boshqa fermentlar - nukleaza, polinukleotilkinaza, teskari transkriptaza, DNK polimeraza 1, suzal nukleotidintransferaza va boshqalar. Gen injeneriyasidagi manupulyasiyalarda qo’llaniladi. Gen injeneriyasida qo’llaniladigan fermentlar tur spesifikasiga qaramaydi, boglik emas, shu sababli eksperimentator kelib chiqishi har xil bo’lgan DNK fragmentlarini uzi xoxlagan tartibda bir butun qilib birlashtirishi mumkin. Gen injeneriyasi tabiatda mavjud bilgan turlar o’rtasidagi to’siqni yangib har xil turlar o’rtasida chatishitirish utkazishi mumkin. Dezoksipolinukleotidlar sintezi gen injenerisiyada keng qo’llanilmaydi degan tushunchalar bor edi. Bu fikrlar xato edi. Keyinchalik eukariotlarning geni mozaik strukturaga ega ekanligi va ulardan to’g’ridan- to’g’ri foydalanish mumkin emasligi aniklandi. Shu sababli ximiyaviy sintez usullari effektiv xisoblanadi. Gen injeneriyaning asosiy manipulyasiya ob’ekti bo’lib genlar (gen) xizmat qiladi, ya’ni DNK fragienti irsiyatining funksional birligi xizmat qiladi, u odatda ma’lum oqsilni kodlaydi. Gamil’ton Smit tasadifgan Haemophilus influennzae bakteriyasi yot faglar DNKning tez parchalashini anikladi. Keyinchalik izlanishlar shuni kursatdiki, bu ta’sir E.coli DNKsini buzuvchi xakikiy restriksiyalovchi ferment ta’siriga boglikdir. Lekin bu Haemophilus DNKsiga ta’sir qilmaydi. Bu restriktaza Hind II deb nomlanib u toza xolda ma’lum tartiblar bilan boglanadi. (5')GTPy! PuAC (3') (3')CAPu ! PyTG (5') strelkalar parchalanishining anik joyini kursatadi. Ru va Ri simvollari esa po’rin va pirimidin qoldigini kursatadi. Shundan beri spesifik tartibli nukleotidlarni parchalovchi restriktazalar 230 ta bakteriya shtammlaridan ajratilib, 90dan ortik restriksiya saytlari identifikasiyalandi. Bu fermentlarning ba’zilari 4ta nukleotiddan iborat spesifik guruxlarni, boshqalari esa geksanukleotidli tartiblarni "taniydi". Tetranukleoidlarni tonuvchi restriktazalar har bir DNKda ko’p uzilishlar beradi, geksanukleotidlarga kura. Virus DNKsida geksonukleotidni sayt restriksiyasi umuman bo’lmasligi mumkin. Masalan: T7 fagi DNKsida 40000 juft nukleotid bo’lib E.colining R1 restriktazasi tanuvchi GAATTC, CTTAAG tartib umuman yo’q. Biror bir restriktaza yordamida parchalanuvchi spesifik virus DNKsidan hosil bo’ladigan har xil fragmentlarni agarozli gelda elektroforezlash yo’li bilan oson ajratish mumkin. Fragmentlarning migrasiyasi tezligi ularning uzunligiga boglik kiska fragmentlar uzun fragmentlarga qaraganda ancha tez migrasiyalanadi. Nisbatan yuqori konsentrasiyali agorozada katta fragmentlar umuman gelda yutilmaydi kirmaydi. Bunday restriksiyalangan fragmentlar agarozoli gelda degradasiyalanmaydi, va ularni biologik aktiv kush zanjirli molekula shaklida ajratish mumkin. Bu gellarni buyok bilan buyalganda bir kator chiziklar (poloski) hosil bo’ladi. Bu chiziklarning har biri ma’lum restriksion fragmentga mas keladi, va uni ma’lum molekulyar og’irlikka ega bo’lgan DNK bilan kolibrovkalab uning molekulyar og’irligini aniklash mumkin. Odatda uncha ko’p sonda bo’lmagan saytlarni tamiydiga restriktazalar qulay bo’lib, uncha ko’p sonda bo’lmagan fragmentlar beradi va ular agarli gelda yaxshi ajraladi. Hind II kabi restriktazalar DNKning saytini o’rtasidan parchalaydi va tumtok uchli fragmentlar hosil qiladi, ularda DNKning kush zanjiri tulik birikkan va yopishmaydi Eco R1 esa shunday uzilish hosil qiladiki, fragment oxirida kiska bir zanjirli 4ta nukleotiddan iborat" dum" hosil bo’ladi. SV 40 ning halqali DNKsi parchalanishidan hosil bo’ladigan zanjirli molekula, yana halqa bo’lib birikadi, bu birikishni DNK-ligaza tikishi mumkin. Epishkok uchlar fermentativ yo’l bilan, tumtok uchli DNK molekulasiga biriktirish mumkin. Buzok timusidan olingan transferaza fermetining qo’llanilishi, bu ferment nukleotilarini DNKning 3' uchiga biriktiradi, natijada har qanday tumtok uchli DNK yopishkok uchli fragmentga aylantirilishi mumkin. Masalan: har qanday 3' uchga poly(dA), va boshqa fragmentning 3' uchiga poly(dT) biriktirilsa va bu fragmentlar aralashtirilishi natijasida komplementar bir zanjirli uchlar juftlashadi. DNK-ligaza kushilishi natijasida fragmentlar kovalent boglanishadi. Hozirgi vaqt rekombinant DNKolishining bu usuli keng qo’llaniladi. 4.3. Kichiq plazmidalar,bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish. Eco R1 yopishkok uchli fragmentlar hosil qilishi ma’lum bo’lgandan keyin har xil DNK fragmentlarini sistematik klonlash usuli topildi. Uning asosiga Eco R1 -fragmentli DNK molekulasini halqali plazmida DNK kiritish yotadi. Bu gibrid plazmida hosil bo’lishiga olib keladi, uni bakteriya hujayrasiga kiritish mumkin. Bunda har bir hujayra uzida yot DNK fragmentini biriktirgan plazmidagi kiritishi mumkin. Birinchi shunday ekperimentlarda E.colining rSC101 plazmidalidan foydalanildi, chunki u Eco R1 parchalanishini bitta saytiga ega va demak u restriktaza ta’sirida chizikli molekulaga aylanadi. Bunday DNK xudda shunday yopishkok uchli yot DNK bilan aralashtirilganda yangi gibrid plazmida hosil bo’ladi. Ularning har birida xech bo’lmasa yot DNK fragmenti bo’lib, plazmidaning Eco R1 saytiga birikib olgan bo’ladi. Izlanuvchi vektor xususiyatini hujayra xususiyatlariga moslashtirishi zarur. Vektorda genetik marker bo’lib, shunga qarab seleksiya utkazish mumkin. Prokariot sistemalarda ko’pincha bu har xil antibiotiklar - ampisilin, tetrasiklin v. xzoga chidamlilik markeri mavjud. Xujayin-hujayrasi rekombinant DNK molekulasi funksiyalashning uchun eng birinchi muhitdir. Hozirgi vaqtda ko’pincha E.coli, B.subtilis, achitqi va boshqa mikroorganizmlar qo’llaniladi. Rekombinant DNK hujayraga kiritilgandan keyin (transformasiya) molekulyar klonlashtirish, ya’ni hosil qilini rekombinant DNK avlodini olish boshlanadi. Buning uchun transformasiyalangan hujayralar o’sishi uchun sharoit yaratiladi. Masalan: muhitga u yoki bu antibiotik kushiladi. Oxirida absolyut gomogen shtamm olinadi, undan quyilgan maksadi karib klonlangan gen yoki uning mahsuloti ajratib olinadi. Plazmidli vektor pBR322 2 xil genetik markerni uz ichiga oladi ampisillin (AR) va tetrasiklin(Ts) antibiotiklariga rezistentlik. Restriksiyalovchi endonukleazalar Bam HI yordamida polinukleotid halqa Te geni kismida uziladi- kesiladi. Natijasida 5'-GATCli yopishkok uchlar paydo bo’ladi va Te gen inaktivlanadi.5'-GATC uchli sintetik gen olinadi. Bu gen va uzilgan vektor pBR322 ligaza T4 fermenti yordamida uzilgan boglar tiklanadi va akasriyat xollarda sintetik gen vektorga birikladi va rekombinant DNK hosil qiladi. Aralashmada endi ikki xil navli siklik molekulalar - pBR 322 vektorlari va rekombinant gen tashuvchi plazmidalar bo’ladi. Ular ampisillinga rezistent (chidamili) , lekin vektor tetrasiklinga ham rezistent bo’ladi, rekombinant plazmidalar esa aknlcha chidamsizdir. Bu esa selektiv muhitda kerakli geni bo’lgan rekombinantlarni ajratish imkonini beradi. Gen injeneriyasi uzining birinchi kadami bilan yangi kutilmagan xodisalarni ochdi. Bunday yangiliklarga birinchi navbatda eukariot genlarning mozaik strukturasi kiradi,ya’ni ular oqsilni kodlovchi kism (ekzonlar) va oralik (intron) , oqsilga alokasi bo’lmagan kismlardan iboratligi aniklandi. Genlarning mozaik strukturasining aniklanishi muhim ahamiyatga ega bo’ladi, u avval ma’lum bo’lmagan iRNKning hosil bo’lish etapini ochishga olib keldi, ya’ni birlamchi nusxadan intronning kesib olinishi va ekzonning biriktirib iRNKning oxirgi shakllangannin olishga olib keldi. kDNKni plazmida tarkibida klonlab xromosoma genlarining strukturasini to’g’ridan- to’g’ri urganish mumkin, lekin ulardan transkripsiyalanadigan mRNKni emas. Lekin kodlanadigan gendan tashkarida bo’lgan regulyasiyalaydigan tartiblarni urganish uchun xromosoma DNKsining ancha uzun fragmentlari bilan manipulyasiya qilishga to’g’ri keladi. Amalda minglab ximera plazmida olish mumkin, ularning har biri DNK (odam, sichkon, tovuk)ning spesifik fragmentlariga ega bo’ladi. Ko’p sandagi bunday plazmidalarini skrininglab bu organizmlarning tulik genomini urganish mumkin. Lekin katta DNK bo’lagiga ega bo’lgan plazmida barkaror bo’lmaydi, replikasiyada sekin asta kichrayib boradi, ya’ni delesiya natijasida yot DNK nukleotidlari soni kamayib boradi. Buning sababi shundaki, plazmida kancha kichiq bo’lsa shuncha tez replikasiyalanadi. Shu sabab- li plazmida ko’payishi uchun kerak bo’lmagan genetik material tez yo’qoladi. Delesiya chastotasi kDNK klonida bir necha mingdan ko’p nukleotidlar bo’lsa ancha ortadi. Xromosoma DNKsining katta bo’lanlari (15 kv) plazmida tarkibida juda ham barkaror emas, lekin ularni biz maxsus konstruksiyalangan L fagi shtammlariga biriktirsak ancha barkoror bo’lib koladi. Faglar eukariotlarining spesifik genlariga ega bo’lgan, "bibliotekasi" olinandan keyin uni plazmidaga klonlangan kDNK yordamida oson skrisninglash mumkin. Bunda ham radioaktiv nishonlanganlangan zondlar yordamida kDNKga komplementar tartibga ega bo’lgan fag koloniyalari identifikasiyalanadi. Sut emizuvchilar gaploid nabor xromosomalari 3*10 juft asoslarga ega. DNK L fagga klonlanganda har bir fragment o’rtacha 1,5*10 juft nukleotidda iborat bo’ladi. Shunday qilib faqat 1mln fagning skrining sut emizuvchilarning butun genomini urganish imkonini beradi. Agar spesifik kDNK bo’lsa, kerakli genni Lfagi bibliotekasidan topish ko’pi bilan bir necha xafta vaqtni oladi. Fagda klonlangandi eukariotik genom segmentining ulchovi 15kv bilan chegaralanadi. Ko’p xollarda bu butun gen va u bilan boglik tartiblar olish uchun etarlidir. Lekin izlanishlar shuni kursatadiki ko’p genlar ancha uzun bo’lib ular 35- 40 kv nukleotidlarga ega bo’ladi. Undan tashkari L fagida klonlab odatda 2ta yakin turgan genlardan rekombinant DNK ajratish mumkin emas. Juda uzun eukariotip DNK fragmentlarini E.colida klonlash kosmidalarda olib boriladi. Bu usul shuncha asoslangaki L fag DNKsi 2ta uchida komplementar bir zanjirli kism bo’lib unga cos-sayt deb ataladi. Fag- ning normal hayotiy siklida fagning yuzlab DNK molekulalari uzun zajiirga birikadi, ya’ni konkotamerga birikadi, bunda L fagi har biri boshqasi bilan cos-sayt bilan birikkan bo’ladi. Fag DNKsini joylashishini (ulolovka) katalizklovchi fermentlar bu konkatemerda 2ta bir biridan 35-45 kv mosofada turgan cos-saytlarni toniydi va ular oraligida turgan fag genomini kesib ajratadi va uni fag boshchasiga joylashtiradi. Shunday qilib cos-sayt bu DNKni fag boshchasiga joylashishida muhimdir. Lfagi cos-sayti pBR322 plazmidaning ampisillinga chidamliligiga kloninib, tetrasiklinga chidamlilik gen faol saqlanib koladi. eukariotik DNK-restriktaza yordamida kisman gidrolizlanadi. Bunda nisbatan uzun DNK fragmentlari hosil bo’ladi. Keyin bu fragmentlar aralashmasi plazmidaning cos-sayti bilan biriktiriladi. Sos-sayt ham shu ferment yordamida gidrolizlanadi. Bunda intakt TetR genni intakt DNK ximera aralashmasi hosil bo’ladi. Bu aralashmada eukariotik DNK fragmenti cos-sayt bilan tugagan. Bu aralashmaga L fagi DNKsini joylashishini katalizlovchi ekstrakt kushilganda, 35-45 kv eukariotik DNK fragmentlarini taniydi va ajralish sodir bo’ladi va ular fag boshchasiga joylashadi. eukariotik DNKning kiska fragmentlari ularda cos-sayt bo’lsa ham fag boshida joylashmaydi. Bunday DNKli fag boshchasi anikki ko’paya olmaydi . Sungra ular bilan ishlov berilgan E.coli tetrasiklinga chidamliligi buyicha tanlanadi. E.coli ichiga tushgandan keyin gibrid molekula plazmida kabi ko’payadi. Kosmidalarda klonlash effektivligi fagga qaraganda past va kosmida bibliotekasini kam miqdorda DNK bo’lgan organizmlar bilan ishlaganda olish qulay (masalan: drozofila). Klonlangan genlarni topish uchun zondlar. Agar biz odam to’qimasidanmi yoki boshqa to’qimadan summar DNK ajratib , uni kerakli restriktaza bilan fragmentlarga parchalasak va bu fragmentlarni plazmidali vektorga kiritsak sungra hosil bo’lgan rekombinant DNKni bakteriyalar populyasiyasiga kiritisak, unda biz odam genlari bibliotekasiga ega bo’lamiz. Bu katalogsiz biblioteka bo’lib, biz bunda kerakli genga ega bo’lgan bakteriyani ajratish muammosiga duch kelamiz. Bu ish juda qiyin bo’lib hozirgi vaqtda zondlar qo’llaniladi. Ularning qo’llanilishi nuklein kislotalarining komplementarligiga asoslangan. Bunday zond radioaktiv nishanlangan mRNK bo’lishi mumkin. va ajratish kerak bo’lgan genga mos keladi. Bunday mRNKga ega bo’lib genlar bibliotekasini skrininslash mumkin va bu zondga komplementar DNKga ega bo’lgan bakteriyani topish mumkin. Bu ishda odatda bitta to’siq bor: u ham bo’lsa juda toza mRNK olishining juda qiyinligidir. Masalan: shakllangan eritrositlarda globinli mRNK summlar RNKning faqat yarimini tashkil etadi. Shakllangan eritrositlarda esa gemoglobinga hujayra oqsillining 90%ga yakini to’g’ri keladi. Agar zond sifatida tulik tozalanmagan mRNKdan foydalanib klonlangan genni izlasak xotoga yo’l quyishi mumkin. Shu sababli boshqa usullardan foydalanib toza zondlar olish mumkin. Odatda hamma mRNK (eukariotlarda) 3' uchida poly (A) tartiblar bo’ladi. Roly (A) DNKning mRNKga komplementar zanjirini sintezlash imkonini beradi. Agar mRNK bilan kiska oligo (dT)aralashtirilga ular poly (A) bilan gibridizasiyalanadi va teskari transkriptaza ferment uchun zatravka rolini bajaradi. Bu ferment ba’zi RNKli onkogen viruslardan ajratilib RNKni matrisa sifatida foydalanib DNKning komplementar zanjirini sintezlashi mumkin. Reaksiya mahsuloti bo’lib RNK- DNK gibridi hosil bo’ladi. Yangi sintezlangan DNK zanjiri oxirida ilgan bo’lib, sungra u uz nusxasini ola boshlaydi. Hosil bo’lgan kush spiralli kDNK bunday ilgakni intakt xolda bo’lib, uni S1-nukleaza parchalashi mumkin. Shu tarika hosil bo’lgan kush spiralli DNK pBR322 plazmidasiga birikadi. Birikish DNK -ligaza yordamida ruy beradi sungra rekombinant plazmida E.colining kerakli shtammiga kirgiziladi. U erda plazmida ko’payadi.