ТEXNIKA HAVFSIZLIK QOIDALARI BILAN TANISHISH MOLEKULYAR BIOLOGIYANING METODLARI

Yuklangan vaqt

2024-04-07

Yuklab olishlar soni

1

Sahifalar soni

15

Faytl hajmi

49,9 KB


ТEXNIKA HAVFSIZLIK QOIDALARI BILAN TANISHISH MOLEKULYAR BIOLOGIYANING METODLARI Biokimyo laboratoriyasida ishlaganda e’tibor qilmasa havfli oqibatlarga olib kelishi mumkin bo’lgan ehtiyaot choralariga amal qilish zarur. Zaharli, engil yonuvchi, portlovchi, kimyoviy kuydiruvchi xususiyatiga ega bo’lgan moddalar bilan ishlaganda, bu ehtiyoj choralariga ayniqsa amal qilish kerak. Pipetka bilan ishlaganda qisman suyiltirilgan va kontsentrlangan kislotalar (azot, sulfat, xlorid, sirka kislotalari) zaharli va zaharli moddalarni og’iz bilan tortish mumkin emas, balki rezina nok yoki silidrdan foydalanish zarur. Xrom aralashmasini ishlatishda ham bunga amal qilish kerak. Zararli gaz yoki bug’lar hosil qiladigan (azot, xlorid, sirka kislota va boshqalar), kukun xolidagi changlanadigan moddalarni ishlatganda dokali respiratorlar va himoya ko’zaynagidan hamda mo’rili shkafdan foydalanish kerak. Turli asboblar 220V kuchlanishili elektr tokidan foydalanilganligi sababli laboratoriyada umumiy yerga ulanish kontur tizimi ta’minlangan bo’lishi kerak. Bu asboblardan foydalanishning nafaqat havfsizligini, balki asboblar ko’rsatkichlarining aniqligini ham ta’minlaydi. Havfsizlik maqsadida oxirgi paytda elektr asboblar qo’shimcha yerga ulanish –kontakt simlari bor maxsus vilka va rezetkalar bilan chiqarilmoqda. Shuning uchun ularni qo’shimcha yerga ulash shart emas. Laborant material bilan ishlaganda ehtiyotlik va e’tibor bilan ishlashi kerak. Bu materiallar bilan ishlagandan so’ng darhol materialni va ishlatilgan idishlarni ham zararsizlantirish ya’ni kimyoviy va termik ishlov berish zarur. 2-3 jadvallarda eng ko’p ishlatiladigan zaharli, yonuvchan va portlovchi kimyoviy moddalarni saqlash qoidalari, kuyish va zararlanishda ko’rsatiladigan birinchi yordan haqida ma’lumot beriladi. ТEXNIKA HAVFSIZLIK QOIDALARI BILAN TANISHISH MOLEKULYAR BIOLOGIYANING METODLARI Biokimyo laboratoriyasida ishlaganda e’tibor qilmasa havfli oqibatlarga olib kelishi mumkin bo’lgan ehtiyaot choralariga amal qilish zarur. Zaharli, engil yonuvchi, portlovchi, kimyoviy kuydiruvchi xususiyatiga ega bo’lgan moddalar bilan ishlaganda, bu ehtiyoj choralariga ayniqsa amal qilish kerak. Pipetka bilan ishlaganda qisman suyiltirilgan va kontsentrlangan kislotalar (azot, sulfat, xlorid, sirka kislotalari) zaharli va zaharli moddalarni og’iz bilan tortish mumkin emas, balki rezina nok yoki silidrdan foydalanish zarur. Xrom aralashmasini ishlatishda ham bunga amal qilish kerak. Zararli gaz yoki bug’lar hosil qiladigan (azot, xlorid, sirka kislota va boshqalar), kukun xolidagi changlanadigan moddalarni ishlatganda dokali respiratorlar va himoya ko’zaynagidan hamda mo’rili shkafdan foydalanish kerak. Turli asboblar 220V kuchlanishili elektr tokidan foydalanilganligi sababli laboratoriyada umumiy yerga ulanish kontur tizimi ta’minlangan bo’lishi kerak. Bu asboblardan foydalanishning nafaqat havfsizligini, balki asboblar ko’rsatkichlarining aniqligini ham ta’minlaydi. Havfsizlik maqsadida oxirgi paytda elektr asboblar qo’shimcha yerga ulanish –kontakt simlari bor maxsus vilka va rezetkalar bilan chiqarilmoqda. Shuning uchun ularni qo’shimcha yerga ulash shart emas. Laborant material bilan ishlaganda ehtiyotlik va e’tibor bilan ishlashi kerak. Bu materiallar bilan ishlagandan so’ng darhol materialni va ishlatilgan idishlarni ham zararsizlantirish ya’ni kimyoviy va termik ishlov berish zarur. 2-3 jadvallarda eng ko’p ishlatiladigan zaharli, yonuvchan va portlovchi kimyoviy moddalarni saqlash qoidalari, kuyish va zararlanishda ko’rsatiladigan birinchi yordan haqida ma’lumot beriladi.
Shuni esda tutib turish lozimki, kimyo laboratoriyalarida taxnika xavfsizligiga rioya qilmaslikturli jarayonlarga olib kelishi mumkin. Zararlanganda va kuyganda shuni qatiyan esda tutish kerakki, teriga, ayniqsa, ko’zga kislota, ishqor tekkanda tanada neytrallash reaksiyalarini qo’llab bo’lmaydi. Har qanday neytrallash reaksiyasi (kislotaga kuchsiz ishqor eritmasi, ishqorga esa kuchsiz kislota eritmasi issiqlik ajralishi bilan kechadi). Kimyoviy kuyishga termik kuyish eng etarli va samarali choradir. ZAHARLI VA YONUVCHAN KIMYOVIY MODDALAR NOMI ORGANIZMGA TA’SIRI YONUVCHANLIK XAVFI SAQLASH Kislotalar Azot kislotasi Butun nafas yo’llari va ko’zlarni achishtiradi. Terini kuydiradi Yonuvchan moddalarning alangalanishiga yordam beradi. Qaytaruvchilar bilan yaxshiprotiva gaz taqish kerak, yonuvchan materiallar bilan kontaktda bo’lganda ularni alangalatadi uni faqat qum, kul bilan uchirish kerak. Suv ishlanmang! Shisha idishlarda saqlanadi Yonuvchan materiallar, material kukunlari, pikrin va xlor kislotalar Sulfat kislota Terini kuchli kuydiradi. Ayniqsa teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi Yonuvchan emas. Suv bilan kontaktda yonuvchan moddalarni alangalatishi mumkin. Shisha idishlarda 16o c dan yuqori haroratda saqlanadi Shuni esda tutib turish lozimki, kimyo laboratoriyalarida taxnika xavfsizligiga rioya qilmaslikturli jarayonlarga olib kelishi mumkin. Zararlanganda va kuyganda shuni qatiyan esda tutish kerakki, teriga, ayniqsa, ko’zga kislota, ishqor tekkanda tanada neytrallash reaksiyalarini qo’llab bo’lmaydi. Har qanday neytrallash reaksiyasi (kislotaga kuchsiz ishqor eritmasi, ishqorga esa kuchsiz kislota eritmasi issiqlik ajralishi bilan kechadi). Kimyoviy kuyishga termik kuyish eng etarli va samarali choradir. ZAHARLI VA YONUVCHAN KIMYOVIY MODDALAR NOMI ORGANIZMGA TA’SIRI YONUVCHANLIK XAVFI SAQLASH Kislotalar Azot kislotasi Butun nafas yo’llari va ko’zlarni achishtiradi. Terini kuydiradi Yonuvchan moddalarning alangalanishiga yordam beradi. Qaytaruvchilar bilan yaxshiprotiva gaz taqish kerak, yonuvchan materiallar bilan kontaktda bo’lganda ularni alangalatadi uni faqat qum, kul bilan uchirish kerak. Suv ishlanmang! Shisha idishlarda saqlanadi Yonuvchan materiallar, material kukunlari, pikrin va xlor kislotalar Sulfat kislota Terini kuchli kuydiradi. Ayniqsa teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi Yonuvchan emas. Suv bilan kontaktda yonuvchan moddalarni alangalatishi mumkin. Shisha idishlarda 16o c dan yuqori haroratda saqlanadi
O’tni qum va kul bilan o’chiriladi Xlorid kislota Terini kuchli kuydiradi, ayniqsa teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi Yonuvchan emas. Oksidlovchi Konsentrlangan sulfat kislotasi va yonuvchan moddalar bilan aralashtirilganda portlaydi Shisha idishlarda 16o c dan yuqori haroratda saqlanadi Fosfat kislota Terini kuchli kuydiradi, ayniqsa, teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi. Yonuvchan moddalar bilan kontaktda bo’laganida ularni alangalatadi Shisha idishlarda 16o C dan yuqori haroratda saqlanadi Kaltsiy ishqori(so’ndiri lmagan ohak) Terini achishtiradi va kuydiradi Yonuvchan havo bilan aralashma hosil qiladi. Suv va CO2 bilan o’chiriladi Shisha yoki plastmassa idishlarda saqlanadi Kuyish Yordam Olov, bug’, qizib turgan predmet bo’lagi bilan: Birinchi darajali (qizaradi) Etil spirtiga ho’llangan paxta qo’yiladi, ho’llash qaytariladi Ikkinchi darajali (pufaklar) Yuqoridagidek va 3-5% li kaliy permanganat yoki 5% li tannin eritmasi bilan artiladi V) uchunchi darajali (to’qimalarning shikastlanishi) Steril bog’lam qoyib, shifokorni chaqirish kerak O’tni qum va kul bilan o’chiriladi Xlorid kislota Terini kuchli kuydiradi, ayniqsa teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi Yonuvchan emas. Oksidlovchi Konsentrlangan sulfat kislotasi va yonuvchan moddalar bilan aralashtirilganda portlaydi Shisha idishlarda 16o c dan yuqori haroratda saqlanadi Fosfat kislota Terini kuchli kuydiradi, ayniqsa, teri va ko’z shilliq pardasiga kuchli ta’sir qiladi. Yonuvchan moddalar bilan kontaktda bo’laganida ularni alangalatadi Shisha idishlarda 16o C dan yuqori haroratda saqlanadi Kaltsiy ishqori(so’ndiri lmagan ohak) Terini achishtiradi va kuydiradi Yonuvchan havo bilan aralashma hosil qiladi. Suv va CO2 bilan o’chiriladi Shisha yoki plastmassa idishlarda saqlanadi Kuyish Yordam Olov, bug’, qizib turgan predmet bo’lagi bilan: Birinchi darajali (qizaradi) Etil spirtiga ho’llangan paxta qo’yiladi, ho’llash qaytariladi Ikkinchi darajali (pufaklar) Yuqoridagidek va 3-5% li kaliy permanganat yoki 5% li tannin eritmasi bilan artiladi V) uchunchi darajali (to’qimalarning shikastlanishi) Steril bog’lam qoyib, shifokorni chaqirish kerak
Zaharlanishlar Aldigidlar Ko’p miqdorda sirka yoki limon sharbati qo’shilgan suv ichiriladi va qustriladi. Osimlik moyi, sut yoki tuxim oqi beriladi. Ammiyak Qustriladi. Natriy gidrosulfatning 1% eritmasi va kraxmal kleysteri yoki sut ichiriladi Yod Og’izni suv yoki 5% li natriy bikarbanat eritmasi bilan chayiladi. Sut, ohak suvi, o’simlik moyi, suyuq xamir ichiriladi. Kislotalar Oshqozonni natriy permanganatning (1:1000) eritmasi bilan yuviladi. Shu tuzning 1% eritmasidan har 5 min.da osh qoshiqda beriladi yoki kuydirilgan magnezi (30/0) oqsilli suv, tuzli ich surgilar beriladi Mis va uning tuzlari Oshqozon yuviladi. Ichirish uchun – shilimshiq qaynatmalar, tannin, ko’mir ichiriladi, og’iz kaliy xlorat bilan chayiladi Kaliy permanganat bilan beriladi 3 ta xom tuxum bilan 1 litrcha sut ichiriladi va qayt qildiriladi Sentrifuga Sentrifuga asbobi yordamida turli xil tizimlarni rotorlarda markazdan qochish kuchi ta’sirida bir biridan ajratiladi. Sentrifugalarda qattiq zarrachalarni cho’ktirish,emulsiyalarni ajratish, filtrlash, yuqori molekulali birikmalarni zichligiga qarab bir-biridan ajratish kabilar amalgam oshiriladi. Bajarilayotgan ishning turiga qarab maxsus konstruksiya qilingan sentrifugalardan foydalaniladi. Biologik tadqiqotlarda sentrifugalardan keng foydalaniladi. Hujayra komponentlarini og’irligiga qarab ajratish, eritmadagi oqsillarni cho’kmaga tushirib olish shular jumlasidandir. Zaharlanishlar Aldigidlar Ko’p miqdorda sirka yoki limon sharbati qo’shilgan suv ichiriladi va qustriladi. Osimlik moyi, sut yoki tuxim oqi beriladi. Ammiyak Qustriladi. Natriy gidrosulfatning 1% eritmasi va kraxmal kleysteri yoki sut ichiriladi Yod Og’izni suv yoki 5% li natriy bikarbanat eritmasi bilan chayiladi. Sut, ohak suvi, o’simlik moyi, suyuq xamir ichiriladi. Kislotalar Oshqozonni natriy permanganatning (1:1000) eritmasi bilan yuviladi. Shu tuzning 1% eritmasidan har 5 min.da osh qoshiqda beriladi yoki kuydirilgan magnezi (30/0) oqsilli suv, tuzli ich surgilar beriladi Mis va uning tuzlari Oshqozon yuviladi. Ichirish uchun – shilimshiq qaynatmalar, tannin, ko’mir ichiriladi, og’iz kaliy xlorat bilan chayiladi Kaliy permanganat bilan beriladi 3 ta xom tuxum bilan 1 litrcha sut ichiriladi va qayt qildiriladi Sentrifuga Sentrifuga asbobi yordamida turli xil tizimlarni rotorlarda markazdan qochish kuchi ta’sirida bir biridan ajratiladi. Sentrifugalarda qattiq zarrachalarni cho’ktirish,emulsiyalarni ajratish, filtrlash, yuqori molekulali birikmalarni zichligiga qarab bir-biridan ajratish kabilar amalgam oshiriladi. Bajarilayotgan ishning turiga qarab maxsus konstruksiya qilingan sentrifugalardan foydalaniladi. Biologik tadqiqotlarda sentrifugalardan keng foydalaniladi. Hujayra komponentlarini og’irligiga qarab ajratish, eritmadagi oqsillarni cho’kmaga tushirib olish shular jumlasidandir.
Sentrifuga rotori tez aylangan vaqtta yerni tortish kuchiga nisbatan bir necha marta yuqori bo’lgan markazdan qochish kuchi paydo bo’ladi. Suyuqlikning zichligiga nisbatan suyuqlikdagi zarrachalarning zichligi ancha yuqori bo’lganligi uchun markazdan ajraladi va cho’kmaga tushadi. Stol ustiga qo’yiladigan sentrifugalarda 10 ml shisha sentrifuga probirkalari ishlatiladi. Ular butsimon probirka ushlovchi rotoriga o’rnatiladi. Probirkalarni eng ustki qismigacha to’ldirish tavsiya etilmaydi. Chunki sentrifuga to’xtaganda suyuqlikning bir qismi to’kilib ketadi. Sentrifugada ishlash vaqtida quyidagilarga e’tibor bering: 1. Sentrifugani tekis yerga o’rnatish lozim. 2. Sentrifugani ishlatishda birdaniga yuqori tezlikda ko’tarish man etiladi. Tezlogi asta- sekin oshiriladi. 3. Sentrifugani ishlatish va to’xtash vaqtida uning yuqori qopqog’i yopiq bo’lishi kerak. 4. Sentrifuga probirkalari juft-juft qilib muvozanat holatiga keltiriladi. Muvozanat holatiga keltirilgan probirkalar bir-biriga qarama-qarshi joylashtiriladi. 5. Agar sentrifugada vibratsiya (qaltirash) vujudga kelsa, zudlik bilan to’xtatib,uni sabablarini aniqlab, bartaraf etish zarur. Ko’pincha qaltirashning sababi, juft probirkalarning og’irligi teng emasligidan yoki ulardan birining siljishi tufayli bo’ladi. Oqsillarni gidrolizlash va ularning aminokislotali tarkibini aniqlash Oqsillarning aminokislotali tarkibini aniqlash uchun avvalo ular gidrolizlanishi kerak. So‘ngra xromatografiya usuli yordamida ularning aminokislotali tarkibi aniqlanadi. Reaktivlar: toza oqsil namunasi. 6 n xlorid kislota eritmasi. Ishning borishi. Avvalo oqsillar gidrolizlanadi. Buning uchun 50-100 mg toza oqsil tortib olinadi va shisha ampulaga solinadi, unga 10 ml 6 n xlorid kislota qo‘shiladi. So‘ngra ampula azot bilan to‘ldirilib, uning ochiq tomoni eritish nuli bilan berkitiladi. Qaynayotgan suvda gidroliz 24 soat davom etadi. Gidroliz tamom Sentrifuga rotori tez aylangan vaqtta yerni tortish kuchiga nisbatan bir necha marta yuqori bo’lgan markazdan qochish kuchi paydo bo’ladi. Suyuqlikning zichligiga nisbatan suyuqlikdagi zarrachalarning zichligi ancha yuqori bo’lganligi uchun markazdan ajraladi va cho’kmaga tushadi. Stol ustiga qo’yiladigan sentrifugalarda 10 ml shisha sentrifuga probirkalari ishlatiladi. Ular butsimon probirka ushlovchi rotoriga o’rnatiladi. Probirkalarni eng ustki qismigacha to’ldirish tavsiya etilmaydi. Chunki sentrifuga to’xtaganda suyuqlikning bir qismi to’kilib ketadi. Sentrifugada ishlash vaqtida quyidagilarga e’tibor bering: 1. Sentrifugani tekis yerga o’rnatish lozim. 2. Sentrifugani ishlatishda birdaniga yuqori tezlikda ko’tarish man etiladi. Tezlogi asta- sekin oshiriladi. 3. Sentrifugani ishlatish va to’xtash vaqtida uning yuqori qopqog’i yopiq bo’lishi kerak. 4. Sentrifuga probirkalari juft-juft qilib muvozanat holatiga keltiriladi. Muvozanat holatiga keltirilgan probirkalar bir-biriga qarama-qarshi joylashtiriladi. 5. Agar sentrifugada vibratsiya (qaltirash) vujudga kelsa, zudlik bilan to’xtatib,uni sabablarini aniqlab, bartaraf etish zarur. Ko’pincha qaltirashning sababi, juft probirkalarning og’irligi teng emasligidan yoki ulardan birining siljishi tufayli bo’ladi. Oqsillarni gidrolizlash va ularning aminokislotali tarkibini aniqlash Oqsillarning aminokislotali tarkibini aniqlash uchun avvalo ular gidrolizlanishi kerak. So‘ngra xromatografiya usuli yordamida ularning aminokislotali tarkibi aniqlanadi. Reaktivlar: toza oqsil namunasi. 6 n xlorid kislota eritmasi. Ishning borishi. Avvalo oqsillar gidrolizlanadi. Buning uchun 50-100 mg toza oqsil tortib olinadi va shisha ampulaga solinadi, unga 10 ml 6 n xlorid kislota qo‘shiladi. So‘ngra ampula azot bilan to‘ldirilib, uning ochiq tomoni eritish nuli bilan berkitiladi. Qaynayotgan suvda gidroliz 24 soat davom etadi. Gidroliz tamom
bo‘lgach, ampula sovutiladi va eritma chinni kosachaga solinadi. Chinni kosachadagi eritma suv hammomida bug‘latiladi. Quruq kosachaga 3-4 tomchi distillangan suv qo‘shib yana quriguncha bug‘latiladi. Bu jarayon kosachadagi kislotali xususiyati yo‘qolguncha 3-4 marta takrorlanadi. Ampulani muzxonada saqlab qo‘iish ham mumkin. Kislotali gidrolizda triptofan aminokislotasi parchalanib ketadi. Xromatogrammaga tomiziladigan oqsil gidrolizatining miqdori, oqsil tarkibidagi aminokislotalarning mikdoriga bog‘liq bo‘ladi. Agar oqsil tarkibida aminokislotalar ko‘p bo‘lsa, kam hajmdagi gidrolizat va aksincha, aminokislotalar miqdori kam bo‘lsa, ko‘p hajmdagi gidrolizat olinadi. Odatda olingan namuna tarkibidagi oqsil mikdori 0,6 mg dan 2 mg gacha bo‘ladi. Gidrolizatni xromatogrammaga tomizish va aminokislotalarni ajratish yuqoridagi bayon qilingan usul yordamida amalga oshiriladi. Aminokislotalarni yupqa qavatli xromatografiya usulida aniqlash Yupqa qavatli xromatografiya usulida oqsil gilrolizatlari yoki aminokislotalar aralashmasidan barcha aminokislotalarni ajratish mumkin. Yupqa qavat sifatida ko‘pincha silikagel, alyuminiy oqsili, sellyuloza hosilalari va boshqa moddalardan, tayyor holdagi maxsus plastinka (silufol)lardan foydalaniladi. Bu metod ikkita aralashmaydigan suyuqliklar fazasida (harakat qilmaydigan suv fazasi va harakatlanuvchi organik erituvchi fazasi) aminokislotalarning turlicha bo‘linish darajasiga asoslangan. Aminokislotalar suvli fazada ko‘p erisa, organik erituvchilarning frontida sekin harakatlanadi. Barcha aminokislotalarning siljish tezligi turlichadir. Siljish tezligining koeffitsienti quyidagicha hisoblanadi. b a Rf  Bu еrda: a-aminokislota tomizilgan joyidan to shu aminokislota hosil kilgan dog‘ning o‘rtasigacha bo‘lgan masofa, sm; β-eritmaning fronti, sm. Aminokislotalar bo‘lingandan keyin plastinka quritiladi va ningidrin eritmasidan purkaladi. a-aminokislotalar ningidrin bilan o‘zaro ta’sir etib oksidlangach, ammiak, bo‘lgach, ampula sovutiladi va eritma chinni kosachaga solinadi. Chinni kosachadagi eritma suv hammomida bug‘latiladi. Quruq kosachaga 3-4 tomchi distillangan suv qo‘shib yana quriguncha bug‘latiladi. Bu jarayon kosachadagi kislotali xususiyati yo‘qolguncha 3-4 marta takrorlanadi. Ampulani muzxonada saqlab qo‘iish ham mumkin. Kislotali gidrolizda triptofan aminokislotasi parchalanib ketadi. Xromatogrammaga tomiziladigan oqsil gidrolizatining miqdori, oqsil tarkibidagi aminokislotalarning mikdoriga bog‘liq bo‘ladi. Agar oqsil tarkibida aminokislotalar ko‘p bo‘lsa, kam hajmdagi gidrolizat va aksincha, aminokislotalar miqdori kam bo‘lsa, ko‘p hajmdagi gidrolizat olinadi. Odatda olingan namuna tarkibidagi oqsil mikdori 0,6 mg dan 2 mg gacha bo‘ladi. Gidrolizatni xromatogrammaga tomizish va aminokislotalarni ajratish yuqoridagi bayon qilingan usul yordamida amalga oshiriladi. Aminokislotalarni yupqa qavatli xromatografiya usulida aniqlash Yupqa qavatli xromatografiya usulida oqsil gilrolizatlari yoki aminokislotalar aralashmasidan barcha aminokislotalarni ajratish mumkin. Yupqa qavat sifatida ko‘pincha silikagel, alyuminiy oqsili, sellyuloza hosilalari va boshqa moddalardan, tayyor holdagi maxsus plastinka (silufol)lardan foydalaniladi. Bu metod ikkita aralashmaydigan suyuqliklar fazasida (harakat qilmaydigan suv fazasi va harakatlanuvchi organik erituvchi fazasi) aminokislotalarning turlicha bo‘linish darajasiga asoslangan. Aminokislotalar suvli fazada ko‘p erisa, organik erituvchilarning frontida sekin harakatlanadi. Barcha aminokislotalarning siljish tezligi turlichadir. Siljish tezligining koeffitsienti quyidagicha hisoblanadi. b a Rf  Bu еrda: a-aminokislota tomizilgan joyidan to shu aminokislota hosil kilgan dog‘ning o‘rtasigacha bo‘lgan masofa, sm; β-eritmaning fronti, sm. Aminokislotalar bo‘lingandan keyin plastinka quritiladi va ningidrin eritmasidan purkaladi. a-aminokislotalar ningidrin bilan o‘zaro ta’sir etib oksidlangach, ammiak,
aldegid va karbonat kislotaga parchalanadi, ningidrin qaytariladi. Qaytarilgan ningidrin hamda ningidrinning boshqa molekulasi ammiak bilan reaksiyaga kirishib, ko‘k-binafsha rangni beruvchi murakkab mureksid birikmasini hosil qiladi. Kerakli asboblar: xromatografiya kamerasi; termostat; 0,1 ml li pipetka. Reaktivlar. 1.0,1 M sitrat buferi, pH-5,3. 2.0,1 % li ningidrinning asetondagi eritmasi. Xromatografiya plastinkalaridagi rangning turg‘un bo‘lishi uchun ningidrinli reaktivga kadmiy qo‘shiladi. Bu eritma 5:1 nisbatda tayyorlanadi: 1 % li ningidrinning asetondagi eritmasidan -5 qism. 2.Kadmiy asetatining aralashmasi; bu aralashmani tayyorlash uchun 50 ml sirka kislota va 100 ml suv olib aralashtiriladi hamda bu aralashmada 1 g kadmiy asetat eritiladi. So‘ng ushbu eritmadan -1 qism olinadi. 3. Oqsil gidrolizati. 4. “Silufol UV-254” plastinkasi. Ishning borishi. “UV-254” plastinkasini pastki tarafidan 2-2,5 sm o‘lchab olib, oddiy qalam bilan start chizig‘i chiziladi. Tekshirilayotgan oqsil gidrolizatlari bir- biridan 1,5-2 sm oraliq masofada tomiziladi. So‘ng bu oqsil gidrolizatlaridan 10-20 ml olib, tomchilab tomiziladi va dog‘ issiq havo bilan quritiladi-xromatografiya kamerasiga vertikal holatda quyiladi. Xromatofafiyalanish maxsus kameralarda olib boriladi, erituvchi sifatida 0,1 M sitrat buferi pH-5,3 ishlatiladi. Erituvchi kameraga 1-1,5 sm qalinlikda quyiladi. Erituvchi plastinka balandligi 4/5 qismiga ko‘tarilganda, plastinka kameradan olinadi va issiq havoda quritiladi. Shundan so‘ng plastinkaga ehtiyotkorlik bilan 1 % li ningidrinni asetondagi eritmasidan purkaladi. Plastinkani 105°C da termostatda 10 minut davomida qizdiriladi. Natijada aminokislotalar ko‘k-binafsha dog‘lar holida ko‘rinadi. So‘ngra har bir aminokislotani yuqorida ko‘rsatilgan formula yordamida siljish tezligi koeffitsienti (Rf) hisoblanadi. Tekshirilayotgan oqsil gilrolizati bilan birga kontrol (standart) eritmalar ham xromatografiya qilinadi. Bu tekshirilayotgan namunadagi aminokislotalarni tezda aniqlashga imkon beradi. Shuni ta’kidlab o‘tish kerakki, yupqa qavatli xromatografiya usulida aminokislotalar sifat jihatdan baholanadi va ularning miqdorini aniqlashga imkon bo‘lmaydi. aldegid va karbonat kislotaga parchalanadi, ningidrin qaytariladi. Qaytarilgan ningidrin hamda ningidrinning boshqa molekulasi ammiak bilan reaksiyaga kirishib, ko‘k-binafsha rangni beruvchi murakkab mureksid birikmasini hosil qiladi. Kerakli asboblar: xromatografiya kamerasi; termostat; 0,1 ml li pipetka. Reaktivlar. 1.0,1 M sitrat buferi, pH-5,3. 2.0,1 % li ningidrinning asetondagi eritmasi. Xromatografiya plastinkalaridagi rangning turg‘un bo‘lishi uchun ningidrinli reaktivga kadmiy qo‘shiladi. Bu eritma 5:1 nisbatda tayyorlanadi: 1 % li ningidrinning asetondagi eritmasidan -5 qism. 2.Kadmiy asetatining aralashmasi; bu aralashmani tayyorlash uchun 50 ml sirka kislota va 100 ml suv olib aralashtiriladi hamda bu aralashmada 1 g kadmiy asetat eritiladi. So‘ng ushbu eritmadan -1 qism olinadi. 3. Oqsil gidrolizati. 4. “Silufol UV-254” plastinkasi. Ishning borishi. “UV-254” plastinkasini pastki tarafidan 2-2,5 sm o‘lchab olib, oddiy qalam bilan start chizig‘i chiziladi. Tekshirilayotgan oqsil gidrolizatlari bir- biridan 1,5-2 sm oraliq masofada tomiziladi. So‘ng bu oqsil gidrolizatlaridan 10-20 ml olib, tomchilab tomiziladi va dog‘ issiq havo bilan quritiladi-xromatografiya kamerasiga vertikal holatda quyiladi. Xromatofafiyalanish maxsus kameralarda olib boriladi, erituvchi sifatida 0,1 M sitrat buferi pH-5,3 ishlatiladi. Erituvchi kameraga 1-1,5 sm qalinlikda quyiladi. Erituvchi plastinka balandligi 4/5 qismiga ko‘tarilganda, plastinka kameradan olinadi va issiq havoda quritiladi. Shundan so‘ng plastinkaga ehtiyotkorlik bilan 1 % li ningidrinni asetondagi eritmasidan purkaladi. Plastinkani 105°C da termostatda 10 minut davomida qizdiriladi. Natijada aminokislotalar ko‘k-binafsha dog‘lar holida ko‘rinadi. So‘ngra har bir aminokislotani yuqorida ko‘rsatilgan formula yordamida siljish tezligi koeffitsienti (Rf) hisoblanadi. Tekshirilayotgan oqsil gilrolizati bilan birga kontrol (standart) eritmalar ham xromatografiya qilinadi. Bu tekshirilayotgan namunadagi aminokislotalarni tezda aniqlashga imkon beradi. Shuni ta’kidlab o‘tish kerakki, yupqa qavatli xromatografiya usulida aminokislotalar sifat jihatdan baholanadi va ularning miqdorini aniqlashga imkon bo‘lmaydi.
Oqsillar fraksiyalarini poliakrilamid gelida elektroforez usuli bilan aniqlash Oqsillarni elektroforezi analitik maqsadlarida qo‘llaniladi. Disk elektroforez usuli- oqsillarni ma’lum konsentratsiyali va ma’lum molekulalarining g‘alvirli geldagi bo‘linishidir. Disk-elektrsforezni amalga oshirishda poliakrilamid geli qo‘llaniladi. Poliakrilamid geli uch xil qiyomdan tashkil topgan: 1) katta g‘alvirli gelning start qismi; 2) katta g‘alvirli konsentrlovchi gel; 3) kichik g‘alvirli bo‘luvchi gel. Poliakrilamid geli-akrilamid Ch2=CH-CO-NH2 va N 1 N metilenbisakrilamidning CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=NH2 sopolimerizatsiyalanish mahsulotidir. ... | CO ...CO | | ... -CH2-CH-(-CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n | | | | NH2 CO CO CO | | | NH NH2 NH2 | CH2 | NH | CO | …(-CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n-CH-(CH2-CH-)n…- | | | | CO CO CO CO | | | | NH2 NH2 NH2 NH2 Oqsillar fraksiyalarini poliakrilamid gelida elektroforez usuli bilan aniqlash Oqsillarni elektroforezi analitik maqsadlarida qo‘llaniladi. Disk elektroforez usuli- oqsillarni ma’lum konsentratsiyali va ma’lum molekulalarining g‘alvirli geldagi bo‘linishidir. Disk-elektrsforezni amalga oshirishda poliakrilamid geli qo‘llaniladi. Poliakrilamid geli uch xil qiyomdan tashkil topgan: 1) katta g‘alvirli gelning start qismi; 2) katta g‘alvirli konsentrlovchi gel; 3) kichik g‘alvirli bo‘luvchi gel. Poliakrilamid geli-akrilamid Ch2=CH-CO-NH2 va N 1 N metilenbisakrilamidning CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=NH2 sopolimerizatsiyalanish mahsulotidir. ... | CO ...CO | | ... -CH2-CH-(-CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n | | | | NH2 CO CO CO | | | NH NH2 NH2 | CH2 | NH | CO | …(-CH2-CH-)n-CH2-CH-(CH2-CH-)n-CH-(CH2-CH-)n…- | | | | CO CO CO CO | | | | NH2 NH2 NH2 NH2
| CH2 | NH | CO | …CH2-CH-(CH2-CH-)n…- | CO | NH2 Gelning yopishqoqligi, mustahkamligi va elastikligi poliakrilamidni polimerizatsiyalanish va tikilish darajasiga, shuningdek tikilishda ishtirok etgan N,N1-metilenbisakrilamidning miqdoriga bog‘liq. Gel ustuncha shaklida mahkamlangan shisha trubkalarda polimerizatsiya qilinadi. Sopolimerizatsiyalanish reaksiyasi katalizatorlari sifatida oksidlovchi-qaytariluvchi sistemalar ishlatiladi, ular erkin radikallar manbai hisoblanadi, masalan: persulfat ammoniy (NH4)2S2O3 va N,N,N,N1-tetrametiletilendiamin (TEMED): (CH3)2=N-CH2-CH2-N=(CH3)2. Elektrod eritmalari, ya’ni bufer eritmalari, elektroddar bilan gellarning sirgqi qismlarida tok o‘tkazuvchi vazifasini bajaradi, bunday holatlarda buferlarning rN va tarkibi turlicha bo‘ladi. Elektroforez usuli juda yuqori sezgirlikka ega. Bu usul bilan qon zardobi oqsillarning 30 dan ortiq fraksiyalarini aniqlash mumkin. Kerakli asboblar: Elektroforez uchun apparat organik oynadan yasalgan bo‘lib, ikkita elektrodnish rezervuarlardan iborat, yuqori va pastki, har birining hajmi 1,5 l. Ikkala rezervuarlarning ko‘mir elektrodlari bo‘lib, bu elektrodlarga doimiy tok ulanadi. O‘zgarmas tok manbai sifatida UIP-1 pribori ishlatiladi. Reaktivlar. 1. A - eritmasi: 100 ml kolbaga 48 ml 1 n HCI, 36,3 g tris va 0,46 ml TEMED solinadi, erib bo‘lgandan keyin kolbaning belgisigacha suv solinadi. Eritma pH 8,9 ga teng bo‘lishi kerak. 2. B-eritmasi: 100 ml kolbaga 30,0 g akrilamid va 0,8 | CH2 | NH | CO | …CH2-CH-(CH2-CH-)n…- | CO | NH2 Gelning yopishqoqligi, mustahkamligi va elastikligi poliakrilamidni polimerizatsiyalanish va tikilish darajasiga, shuningdek tikilishda ishtirok etgan N,N1-metilenbisakrilamidning miqdoriga bog‘liq. Gel ustuncha shaklida mahkamlangan shisha trubkalarda polimerizatsiya qilinadi. Sopolimerizatsiyalanish reaksiyasi katalizatorlari sifatida oksidlovchi-qaytariluvchi sistemalar ishlatiladi, ular erkin radikallar manbai hisoblanadi, masalan: persulfat ammoniy (NH4)2S2O3 va N,N,N,N1-tetrametiletilendiamin (TEMED): (CH3)2=N-CH2-CH2-N=(CH3)2. Elektrod eritmalari, ya’ni bufer eritmalari, elektroddar bilan gellarning sirgqi qismlarida tok o‘tkazuvchi vazifasini bajaradi, bunday holatlarda buferlarning rN va tarkibi turlicha bo‘ladi. Elektroforez usuli juda yuqori sezgirlikka ega. Bu usul bilan qon zardobi oqsillarning 30 dan ortiq fraksiyalarini aniqlash mumkin. Kerakli asboblar: Elektroforez uchun apparat organik oynadan yasalgan bo‘lib, ikkita elektrodnish rezervuarlardan iborat, yuqori va pastki, har birining hajmi 1,5 l. Ikkala rezervuarlarning ko‘mir elektrodlari bo‘lib, bu elektrodlarga doimiy tok ulanadi. O‘zgarmas tok manbai sifatida UIP-1 pribori ishlatiladi. Reaktivlar. 1. A - eritmasi: 100 ml kolbaga 48 ml 1 n HCI, 36,3 g tris va 0,46 ml TEMED solinadi, erib bo‘lgandan keyin kolbaning belgisigacha suv solinadi. Eritma pH 8,9 ga teng bo‘lishi kerak. 2. B-eritmasi: 100 ml kolbaga 30,0 g akrilamid va 0,8
g metilenbisakrilamid solib, 70-80 ml distillangan suvda eritiladi va filtrlanadi, so‘ngra eritmaning hajmi distillangan suv qo‘shib 100 ml ga еtkaziladi, so‘ng yaxshilab aralashtiriladi. 3. C-eritmasi: 0,14 g ammoniy persulfat 100 ml distillangan suvda eritiladi, bu eritmani ishlatishdan avval tayyorlanadi. 4. Elektrod buferi: 6,0 g tris va 28,8 g glitsin distillangan suvda eritiladi va xajmi suv qo‘shib 100 ml ga еtkaziladi, pH-8,3. Foydalanishdan oldin 10 marta suyultiriladi. 5. Bo‘yoq-indikatorning eritmasi: bromfenol ko‘kning 0,001% li distillangan suvdagi eritmasi. 6. Oqsil fraksiyalarini bo‘yash uchun amido-shvars reaktivi ishlatiladi. Amido-shvars 10 B ni 1% li eritmasi 7% li sirka kislotasining eritmasida tayyorlanadi. 7.Sirka kislotasining 7% li eritmasi. 8.Qon zardobi. Ishning borishi. Gelni tayyorlash. Toza va quruq trubkalarning bir uchini leykoplastir yopishtirib berkitiladi va rezinali halqachalar kiygiziladi, so‘ngra shtativga o‘rnatiladi. Alohida kolbaga yoki stakanga 1 qism A eritmadan, 2 qism B eritmadan, 4 qism C eritmadan va 1 qism distillangan suv olib aralashtiriladi. Tayyorlangan aralashmada har bir trubkalarga pipetka bilan 2,5 ml dan solinadi. Gelning usti bir xil tekis bo‘lishi va kislorod o‘tishining oldini olish uchun kapillyar yordamida 0,2-0,3 ml distillangan suvni aralashma ustiga qavat qilib quyiladi. Trubkalardagi gellarni polimerizatsiyalanish uchun 30 minut xona haroratida yoki termostatda 30°C da 15- 20 minut saqlanadi. Polimerizatsiyalanish tamom bo‘lgandan keyin, gel bilan qavat qilib quyilgan suv filtr qog‘ozdan qirqib tayyorlangan lentachalar bilan olinadi va gelning yuqori qismi elektrod buferi bilan yuviladi. Analiz qilishga ishlatiladigan oqsil eritmasi gel tayyorlash uchun qo‘llaniladigan bufer eritmasidan tayyorlanadi. Oqsil eritmasining konsentratsiyasi 1-5 mkg/ml bo‘lishi kerak. Masalan: qon zardobini tekshirish uchun 3 mkl qon zardobi (oqsil mikdori taxminan 200 mkg) 0,15 ml gel tayyorlash uchun ishlatiladigan bufer eritmasi bilan aralashtiriladi va zichligini oshirish uchun konsentratsiyasi 20-25 % bo‘lguncha saxaroza yoki glitserin qo‘shiladi, har bir trubkaga 10-100 mkl tayyorlangan oqsil eritmasidan solinadi. Shundan so‘ng trubkalar oxirigacha elektrod buferi bilan to‘ldiriladi. g metilenbisakrilamid solib, 70-80 ml distillangan suvda eritiladi va filtrlanadi, so‘ngra eritmaning hajmi distillangan suv qo‘shib 100 ml ga еtkaziladi, so‘ng yaxshilab aralashtiriladi. 3. C-eritmasi: 0,14 g ammoniy persulfat 100 ml distillangan suvda eritiladi, bu eritmani ishlatishdan avval tayyorlanadi. 4. Elektrod buferi: 6,0 g tris va 28,8 g glitsin distillangan suvda eritiladi va xajmi suv qo‘shib 100 ml ga еtkaziladi, pH-8,3. Foydalanishdan oldin 10 marta suyultiriladi. 5. Bo‘yoq-indikatorning eritmasi: bromfenol ko‘kning 0,001% li distillangan suvdagi eritmasi. 6. Oqsil fraksiyalarini bo‘yash uchun amido-shvars reaktivi ishlatiladi. Amido-shvars 10 B ni 1% li eritmasi 7% li sirka kislotasining eritmasida tayyorlanadi. 7.Sirka kislotasining 7% li eritmasi. 8.Qon zardobi. Ishning borishi. Gelni tayyorlash. Toza va quruq trubkalarning bir uchini leykoplastir yopishtirib berkitiladi va rezinali halqachalar kiygiziladi, so‘ngra shtativga o‘rnatiladi. Alohida kolbaga yoki stakanga 1 qism A eritmadan, 2 qism B eritmadan, 4 qism C eritmadan va 1 qism distillangan suv olib aralashtiriladi. Tayyorlangan aralashmada har bir trubkalarga pipetka bilan 2,5 ml dan solinadi. Gelning usti bir xil tekis bo‘lishi va kislorod o‘tishining oldini olish uchun kapillyar yordamida 0,2-0,3 ml distillangan suvni aralashma ustiga qavat qilib quyiladi. Trubkalardagi gellarni polimerizatsiyalanish uchun 30 minut xona haroratida yoki termostatda 30°C da 15- 20 minut saqlanadi. Polimerizatsiyalanish tamom bo‘lgandan keyin, gel bilan qavat qilib quyilgan suv filtr qog‘ozdan qirqib tayyorlangan lentachalar bilan olinadi va gelning yuqori qismi elektrod buferi bilan yuviladi. Analiz qilishga ishlatiladigan oqsil eritmasi gel tayyorlash uchun qo‘llaniladigan bufer eritmasidan tayyorlanadi. Oqsil eritmasining konsentratsiyasi 1-5 mkg/ml bo‘lishi kerak. Masalan: qon zardobini tekshirish uchun 3 mkl qon zardobi (oqsil mikdori taxminan 200 mkg) 0,15 ml gel tayyorlash uchun ishlatiladigan bufer eritmasi bilan aralashtiriladi va zichligini oshirish uchun konsentratsiyasi 20-25 % bo‘lguncha saxaroza yoki glitserin qo‘shiladi, har bir trubkaga 10-100 mkl tayyorlangan oqsil eritmasidan solinadi. Shundan so‘ng trubkalar oxirigacha elektrod buferi bilan to‘ldiriladi.