VIRUSLARNI INDIKATSIYA VA IDENTIFIKATSIYA QILISH USULLARI

Yuklangan vaqt

2024-09-14

Yuklab olishlar soni

1

Sahifalar soni

19

Faytl hajmi

1,5 MB


VIRUSLARNI INDIKATSIYA VA IDENTIFIKATSIYA QILISH USULLARI 1. Mashg'ulot o'tkazish joyi, jixozlanishi: Mikrobiologiya kafedrasi auditoriyalari va laboratoriyasi. Labaratoriya mashg'ulot o'tkazish uchun: virus tutuvchi material, mikroskoplar, pipetkalar, probirkalar, spirt lampalari, buyum oynachalari, bakterial qovuzloq, shtativlar. 2. Mashg'ulotning davomiyligi: 2 soat 3. Mashg'ulotning maqsadlari: Talabalarni viruslarni tuzilishi va kimyoviy tarkibi, ko’payishi, laboratoriyada ajratib olinishi, indikatsiya, identifikatsiya qilish usullari bilan tanishtirish. Vazifalar: Talabalar bilishi lozim: DNK va RNK tutuvchi viruslar haqida (ularni strukturasini, simmetriya tiplari, ximiyaviy tarkibi). Viruslik laboratoriya kullaniladigan, xujayra kulturasini va ularni ochish printsiplari. Viruslarni xujayraga ta'siri va ularni aniqlash usullari. Virusli yukumli kasalliklarga tashxis qo’yish usullari. Talabalar qila olishi kerak: VIRUSLARNI INDIKATSIYA VA IDENTIFIKATSIYA QILISH USULLARI 1. Mashg'ulot o'tkazish joyi, jixozlanishi: Mikrobiologiya kafedrasi auditoriyalari va laboratoriyasi. Labaratoriya mashg'ulot o'tkazish uchun: virus tutuvchi material, mikroskoplar, pipetkalar, probirkalar, spirt lampalari, buyum oynachalari, bakterial qovuzloq, shtativlar. 2. Mashg'ulotning davomiyligi: 2 soat 3. Mashg'ulotning maqsadlari: Talabalarni viruslarni tuzilishi va kimyoviy tarkibi, ko’payishi, laboratoriyada ajratib olinishi, indikatsiya, identifikatsiya qilish usullari bilan tanishtirish. Vazifalar: Talabalar bilishi lozim: DNK va RNK tutuvchi viruslar haqida (ularni strukturasini, simmetriya tiplari, ximiyaviy tarkibi). Viruslik laboratoriya kullaniladigan, xujayra kulturasini va ularni ochish printsiplari. Viruslarni xujayraga ta'siri va ularni aniqlash usullari. Virusli yukumli kasalliklarga tashxis qo’yish usullari. Talabalar qila olishi kerak:
Viruslarni xujayra sitopatik ta'sirini (kiritmalar, xujayrani destruktsiyasi, gemadsorbtsiya, simblast xosil kilishi). Mikroskopda ko’rib aniqlash. Gemagglyutinatsiya reaktsiyasini qo’yish texnikasi. Indikatsiya. № Bajariladigan tadbirlar Bajara bilmadi (ball) To'liq bajardi (ball) 1. 1. Virusning hujayra kulturasiga sitopatik ta'siri (TSPT), bunda kulturada ko'zga ko'rinadigan morfologik degenerativ o'zgarishlar (litik infektsiya) kelib chiqadi. 0 25 2. Zararlangan hujayra kulturasi gemadsortsiya xususiyatiga ega bo'ladi, ya'ni hujayra yuza qavatiga eritrotsitlar adsorbtsiyalanadi. 0 25 3. Zararlangan hujayra kulturasida maxsus agarli qoplamning zich qatlami ostida virusning «negativ koloniyalari» - pilakchalar hosil bo'ladi. 0 25 4. Virus bilan zararlangan hujayra kulturasida metabolizm jarayonlarining bo'lmasligi rangli sinama (rangli reaktsiya) yordamida aniqlanadi. 0 25 Jami 0 100 Identifikatsiya Viruslarni xujayra sitopatik ta'sirini (kiritmalar, xujayrani destruktsiyasi, gemadsorbtsiya, simblast xosil kilishi). Mikroskopda ko’rib aniqlash. Gemagglyutinatsiya reaktsiyasini qo’yish texnikasi. Indikatsiya. № Bajariladigan tadbirlar Bajara bilmadi (ball) To'liq bajardi (ball) 1. 1. Virusning hujayra kulturasiga sitopatik ta'siri (TSPT), bunda kulturada ko'zga ko'rinadigan morfologik degenerativ o'zgarishlar (litik infektsiya) kelib chiqadi. 0 25 2. Zararlangan hujayra kulturasi gemadsortsiya xususiyatiga ega bo'ladi, ya'ni hujayra yuza qavatiga eritrotsitlar adsorbtsiyalanadi. 0 25 3. Zararlangan hujayra kulturasida maxsus agarli qoplamning zich qatlami ostida virusning «negativ koloniyalari» - pilakchalar hosil bo'ladi. 0 25 4. Virus bilan zararlangan hujayra kulturasida metabolizm jarayonlarining bo'lmasligi rangli sinama (rangli reaktsiya) yordamida aniqlanadi. 0 25 Jami 0 100 Identifikatsiya
№ Bajariladigan tadbirlar Bajara bilmadi (балл) To'liq bajardi (ball) 1. 1. Sitopatik ta'sir ko'rsatmaydi – sitopatik ta'sirning neytralizatsiyasi (tormozlanishi) bo'ladi. 0 25 2. Gemadsorbtsiya reaktsiyasini chaqirmaydi - gemadsorbtsiya reaktsiyasi to'xtatilishi kuzatiladi. 0 25 3. Pilakchalar hosil bo'lishiga yo'l qo'ymaydi (yoki ularning soni sezilarli kamayadi) - pilakcha hosil bo'lish reaktsiyasining neytralizatsiyasi amalga oshadi. 0 25 4. Hujayra metabolizmini to'xtatmaydi, bu rangli sinama bo'yicha neytralizatsiya reaktsiyasida aniqlanadi. 0 25 Jami 0 100 4. Mavzuni asoslash: Bir qavatli hujayra kulturalari ko'pgina virusli infektsiyalar diagnostikasida muhim ahamiyatga egadir. Hujayra kulturalari yordamida viruslarni aniqlash (indikatsiya) va tekshiriluvchi materialdan ajratib olish, laborator sharoitda virusni saqlash va virus identifikatsiyasini o'tkazish mumkin. Hujayra kulturalaridan foydalanib tekshiriluvchi zardoblarda viruslarga qarshi antitelolar aniqlanadi. Viruslarni ajratib olish va o'stirishda yuqori moyillikka ega sezuvchan hujayra kulturalari kerak bo'lib, ularda viruslar cheksiz sondagi passajlarda ko'paya olish (reproduktsiyalanish) xususiyatiga ega. Bunday yuqori sezuvchan kulturalar odatda, № Bajariladigan tadbirlar Bajara bilmadi (балл) To'liq bajardi (ball) 1. 1. Sitopatik ta'sir ko'rsatmaydi – sitopatik ta'sirning neytralizatsiyasi (tormozlanishi) bo'ladi. 0 25 2. Gemadsorbtsiya reaktsiyasini chaqirmaydi - gemadsorbtsiya reaktsiyasi to'xtatilishi kuzatiladi. 0 25 3. Pilakchalar hosil bo'lishiga yo'l qo'ymaydi (yoki ularning soni sezilarli kamayadi) - pilakcha hosil bo'lish reaktsiyasining neytralizatsiyasi amalga oshadi. 0 25 4. Hujayra metabolizmini to'xtatmaydi, bu rangli sinama bo'yicha neytralizatsiya reaktsiyasida aniqlanadi. 0 25 Jami 0 100 4. Mavzuni asoslash: Bir qavatli hujayra kulturalari ko'pgina virusli infektsiyalar diagnostikasida muhim ahamiyatga egadir. Hujayra kulturalari yordamida viruslarni aniqlash (indikatsiya) va tekshiriluvchi materialdan ajratib olish, laborator sharoitda virusni saqlash va virus identifikatsiyasini o'tkazish mumkin. Hujayra kulturalaridan foydalanib tekshiriluvchi zardoblarda viruslarga qarshi antitelolar aniqlanadi. Viruslarni ajratib olish va o'stirishda yuqori moyillikka ega sezuvchan hujayra kulturalari kerak bo'lib, ularda viruslar cheksiz sondagi passajlarda ko'paya olish (reproduktsiyalanish) xususiyatiga ega. Bunday yuqori sezuvchan kulturalar odatda,
ko'proq odam hujayralari kulturalari (birlamchi, undiriladigan, diploid), shuningdek maymun buyragidan tayyorlangan hujayra kulturalari hisoblanadi. Hayvon va qushlar to'qimalaridan olinadigan hujayra kulturalari ham ko'p ishlatiladi. Hujayra kulturalarining u yoki bu viruslarga nisbatan yuqori sezuvchanlikka ega bo'lgan alohida turlari mavjud. Masalan, maymunning buyrak hujayralarida polioviruslar, undiriladigan Helahujayra kulturasida – A va V gripp viruslari, tovuk embrioni fibroblastlari birlamchi kulturasida - gerpesviruslar va poksviruslar yaxshi ko'payadi. Shunday qilib, viruslarga sezuvchanlik ham hujayra xususiyatlarini, ham viruslar tabiatini hisobga olgan holda aniqlanadi. Viruslarni yaxshi o'stirish uchun: hujayralar o'sadigan oziq muhit tarkibi, rN ko'rsatkichi, zardobning borligi, inkubatsiya harorati, yosh, hujayra populyatsiyasi zichligi va hayotchanligi, interferon sintezi va boshqa omillar katta ahamiyatga ega. Masalan, paragripp viruslari ozik muhitda zardob bo'lganda reproduktsiyalanmaydi; rinoviruslar esa, hujayra kulturalarida 330S haroratda va probirkalar doimo aylanib turgandagina ko'paya oladi. Bu ma'lumotlarni hisobga olish diagnostikada katta yordam beradi, ajratib olingan virusning dastlabki taxminiy identifikatsiyasini o'tkazish mumkin bo'ladi. Indikatsiya.Hujayra kulturalari virus bilan zararlantirilganda virus ta'sirining turli xil ko'rinishlarini kuzatish mumkin: 1. Virusning hujayra kulturasiga sitopatik ta'siri (TSPT), bunda kulturada ko'zga ko'rinadigan morfologik degenerativ o'zgarishlar (litik infektsiya) kelib chiqadi. 2. Zararlangan hujayra kulturasi gemadsortsiya xususiyatiga ega bo'ladi, ya'ni hujayra yuza qavatiga eritrotsitlar adsorbtsiyalanadi. 3. Zararlangan hujayra kulturasida maxsus agarli qoplamning zich qatlami ostida virusning «negativ koloniyalari» - pilakchalar hosil bo'ladi. 4. Virus bilan zararlangan hujayra kulturasida metabolizm jarayonlarining bo'lmasligi rangli sinama (rangli reaktsiya) yordamida aniqlanadi. Hujayra kulturalarida viruslar ta'sirida namoyon bo'lgan ushbu ko'rinishlar asosiy mezon bo'lib hisoblanadi, ular yordamida viruslar indikatsiyasi o'tkaziladi, ya'ni virusning borligi, shuningdek uning titri, miqdori aniqlanadi. Turli viruslarda ko'proq odam hujayralari kulturalari (birlamchi, undiriladigan, diploid), shuningdek maymun buyragidan tayyorlangan hujayra kulturalari hisoblanadi. Hayvon va qushlar to'qimalaridan olinadigan hujayra kulturalari ham ko'p ishlatiladi. Hujayra kulturalarining u yoki bu viruslarga nisbatan yuqori sezuvchanlikka ega bo'lgan alohida turlari mavjud. Masalan, maymunning buyrak hujayralarida polioviruslar, undiriladigan Helahujayra kulturasida – A va V gripp viruslari, tovuk embrioni fibroblastlari birlamchi kulturasida - gerpesviruslar va poksviruslar yaxshi ko'payadi. Shunday qilib, viruslarga sezuvchanlik ham hujayra xususiyatlarini, ham viruslar tabiatini hisobga olgan holda aniqlanadi. Viruslarni yaxshi o'stirish uchun: hujayralar o'sadigan oziq muhit tarkibi, rN ko'rsatkichi, zardobning borligi, inkubatsiya harorati, yosh, hujayra populyatsiyasi zichligi va hayotchanligi, interferon sintezi va boshqa omillar katta ahamiyatga ega. Masalan, paragripp viruslari ozik muhitda zardob bo'lganda reproduktsiyalanmaydi; rinoviruslar esa, hujayra kulturalarida 330S haroratda va probirkalar doimo aylanib turgandagina ko'paya oladi. Bu ma'lumotlarni hisobga olish diagnostikada katta yordam beradi, ajratib olingan virusning dastlabki taxminiy identifikatsiyasini o'tkazish mumkin bo'ladi. Indikatsiya.Hujayra kulturalari virus bilan zararlantirilganda virus ta'sirining turli xil ko'rinishlarini kuzatish mumkin: 1. Virusning hujayra kulturasiga sitopatik ta'siri (TSPT), bunda kulturada ko'zga ko'rinadigan morfologik degenerativ o'zgarishlar (litik infektsiya) kelib chiqadi. 2. Zararlangan hujayra kulturasi gemadsortsiya xususiyatiga ega bo'ladi, ya'ni hujayra yuza qavatiga eritrotsitlar adsorbtsiyalanadi. 3. Zararlangan hujayra kulturasida maxsus agarli qoplamning zich qatlami ostida virusning «negativ koloniyalari» - pilakchalar hosil bo'ladi. 4. Virus bilan zararlangan hujayra kulturasida metabolizm jarayonlarining bo'lmasligi rangli sinama (rangli reaktsiya) yordamida aniqlanadi. Hujayra kulturalarida viruslar ta'sirida namoyon bo'lgan ushbu ko'rinishlar asosiy mezon bo'lib hisoblanadi, ular yordamida viruslar indikatsiyasi o'tkaziladi, ya'ni virusning borligi, shuningdek uning titri, miqdori aniqlanadi. Turli viruslarda
hujayra kulturalariga ta'sirining u yoki bu ko'rinishi ustun turadi va undan virusning dastlabki identifikatsiyasida foydalaniladi. Identifikatsiya. Ajratib olingan virusning yakuniy identifikatsiyasi virusni neytralizatsiyalovchi diagnostik zardob bilan neytralizatsiya reaktsiyasi yordamida o'tkaziladi. Dastlab virus zardob bilan aralashtiriladi, so'ng aralashma hujayra kulturasiga yuqtiriladi va kelib chiqqan neytralizatsiya tug'risida mezonlar bo'yicha xulosa qilinadi. Virus maxsus zardob bilan neytrallangan bo'lsa: 1. Sitopatik ta'sir ko'rsatmaydi – sitopatik ta'sirning neytralizatsiyasi (tormozlanishi) bo'ladi. 2. Gemadsorbtsiya reaktsiyasini chaqirmaydi - gemadsorbtsiya reaktsiyasi to'xtatilishi kuzatiladi. 3. Pilakchalar hosil bo'lishiga yo'l qo'ymaydi (yoki ularning soni sezilarli kamayadi) - pilakcha hosil bo'lish reaktsiyasining neytralizatsiyasi amalga oshadi. 4. Hujayra metabolizmini to'xtatmaydi, bu rangli sinama bo'yicha neytralizatsiya reaktsiyasida aniqlanadi. Bu usul bilan viruslarning serologik identifikatsiyasi o'tkaziladi, ularni tur va tiplarga mosligi aniqlanadi. Antitelolarni aniqlash. Xuddi shu yul bilan bemor zardobidagi nomalum antitelolarni aniqlash uchun neytralizatsiya reaktsiyasi qo'yiladi. Bu holatda tekshiriluvchi zardob ma'lum virusga qo'shiladi, keyin yukoridagi ko'rsatilgan usullar bilan neytralizatsiya reaktsiyasining bo'lgan bo'lmagani aniqlanadi. Musbat reaktsiya shuni ko'rsatadiki, zardob antitelosi tajribaga olingan ma'lum virusga mos keladi. Hujayra kulturasiga virusning sitopatik ta'siri Sitopatik ta'sir deganda – hujayraga kirgan virus ta'sirida kechadigan hujayradagi morfologik va funktsional (shuningdek, biokimyoviy) o'zgarishlarning yig'indisi tushuniladi. Virus bilan zararlangan hujayraning reaktsiyasi o'tkir virus infektsiyasi, latent infektsiya, hujayralar transformatsiyasi ko'rinishida namoyon bo'ladi. Hujayraning reaktsiyasi o'tkir virusli infektsiyalarda yaqqolroqkuzatiladi. Sitopatik hujayra kulturalariga ta'sirining u yoki bu ko'rinishi ustun turadi va undan virusning dastlabki identifikatsiyasida foydalaniladi. Identifikatsiya. Ajratib olingan virusning yakuniy identifikatsiyasi virusni neytralizatsiyalovchi diagnostik zardob bilan neytralizatsiya reaktsiyasi yordamida o'tkaziladi. Dastlab virus zardob bilan aralashtiriladi, so'ng aralashma hujayra kulturasiga yuqtiriladi va kelib chiqqan neytralizatsiya tug'risida mezonlar bo'yicha xulosa qilinadi. Virus maxsus zardob bilan neytrallangan bo'lsa: 1. Sitopatik ta'sir ko'rsatmaydi – sitopatik ta'sirning neytralizatsiyasi (tormozlanishi) bo'ladi. 2. Gemadsorbtsiya reaktsiyasini chaqirmaydi - gemadsorbtsiya reaktsiyasi to'xtatilishi kuzatiladi. 3. Pilakchalar hosil bo'lishiga yo'l qo'ymaydi (yoki ularning soni sezilarli kamayadi) - pilakcha hosil bo'lish reaktsiyasining neytralizatsiyasi amalga oshadi. 4. Hujayra metabolizmini to'xtatmaydi, bu rangli sinama bo'yicha neytralizatsiya reaktsiyasida aniqlanadi. Bu usul bilan viruslarning serologik identifikatsiyasi o'tkaziladi, ularni tur va tiplarga mosligi aniqlanadi. Antitelolarni aniqlash. Xuddi shu yul bilan bemor zardobidagi nomalum antitelolarni aniqlash uchun neytralizatsiya reaktsiyasi qo'yiladi. Bu holatda tekshiriluvchi zardob ma'lum virusga qo'shiladi, keyin yukoridagi ko'rsatilgan usullar bilan neytralizatsiya reaktsiyasining bo'lgan bo'lmagani aniqlanadi. Musbat reaktsiya shuni ko'rsatadiki, zardob antitelosi tajribaga olingan ma'lum virusga mos keladi. Hujayra kulturasiga virusning sitopatik ta'siri Sitopatik ta'sir deganda – hujayraga kirgan virus ta'sirida kechadigan hujayradagi morfologik va funktsional (shuningdek, biokimyoviy) o'zgarishlarning yig'indisi tushuniladi. Virus bilan zararlangan hujayraning reaktsiyasi o'tkir virus infektsiyasi, latent infektsiya, hujayralar transformatsiyasi ko'rinishida namoyon bo'ladi. Hujayraning reaktsiyasi o'tkir virusli infektsiyalarda yaqqolroqkuzatiladi. Sitopatik
ta'sirning asosiy sababi hujayra metabolizmining buzilishi deb taxmin qilinadi. Xo'jayin hujayrasidagi RNK sintezi to'xtaydi, bu esa oqsil sintezining to'xtashiga, hujayra membranasi, lizosoma, mitoxondriyalar tuzilishining o'zgarishiga olib keladi. Hujayra fermentlari (lizosomal) faollashadi, natijada, hujayra komponentlari destruktsiyasi sodir buladi, ya'ni sitopatik tasir rivojlanadi. Tezkor degeneratsiyada hujayradagi monoqavat o'ladi: hujayralar shishadan ko'chib erkin holatda kultural suyuqlikda don shaklida suzib yuradi va erib ketadi (lizisga uchraydi). Monoqavat hujayralarga virusning sitopatik tasiri «++++» tizimi bo'yicha baholanadi. • «++++» – hujayra kulturasining to'liq lizisi. • «+++» – hujayraviy qavat yo'q, lekin virus bilan zararlanmagan yakka-yakka hujayralar uchraydi. • «++» – 50% hujayra kulturasida degenerativ o'zgarishlar kuzatiladi. • «+» – malum hujayra qavatining ayrim qismlari (asosan, chetki sohalar) degenerativ o'zgarishlarga uchragan bo'ladi (5-rasm). ta'sirning asosiy sababi hujayra metabolizmining buzilishi deb taxmin qilinadi. Xo'jayin hujayrasidagi RNK sintezi to'xtaydi, bu esa oqsil sintezining to'xtashiga, hujayra membranasi, lizosoma, mitoxondriyalar tuzilishining o'zgarishiga olib keladi. Hujayra fermentlari (lizosomal) faollashadi, natijada, hujayra komponentlari destruktsiyasi sodir buladi, ya'ni sitopatik tasir rivojlanadi. Tezkor degeneratsiyada hujayradagi monoqavat o'ladi: hujayralar shishadan ko'chib erkin holatda kultural suyuqlikda don shaklida suzib yuradi va erib ketadi (lizisga uchraydi). Monoqavat hujayralarga virusning sitopatik tasiri «++++» tizimi bo'yicha baholanadi. • «++++» – hujayra kulturasining to'liq lizisi. • «+++» – hujayraviy qavat yo'q, lekin virus bilan zararlanmagan yakka-yakka hujayralar uchraydi. • «++» – 50% hujayra kulturasida degenerativ o'zgarishlar kuzatiladi. • «+» – malum hujayra qavatining ayrim qismlari (asosan, chetki sohalar) degenerativ o'zgarishlarga uchragan bo'ladi (5-rasm).
5- rasm. Virusning sitopatik ta'siri. Morfologik o'zgargan hujayralarning mikroskop ostida ko'rinishi. Simplastlar hosil bo'lishi. O'tkir virusli infektsiyalarda sitopatik tasirning boshqa ko'rinishi kuzatilishi mumkin. Bunda gigant ko'p yadroli hujayralar – simplastlar (yoki sintsitiylar) hosil bo'ladi. 20 turdan ortiq viruslar simplastlar hosil qiladi. Ular o'zida letsitinaza, neyraminidaza va lipidlarga boy fermentlar tutadi (asosan paramiksoviruslar). Fermentlar bir qavatli kultura hujayralarining qobig'iga tasir qiladi va hujayralarning qo'shilib ko'p yadroli sintsitiylar hosil qilishga olib keladi. Kiritmalar. Viruslar sitopatik tasirining ko'rinishiga hujayra ichi kiritmalarining hosil bo'lishi ham kiradi. Agar virus hujayralarni nobud qilmasa, kiritmalar hosil bo'ladi yoki bo'lmasa ularning halok bo'lish bosqichiga yaqin hosil bo'ladi. Kiritmalarning hosil bo'lishi virusga qarshi hujayra reaktsiyasining yagona ko'rinishi bo'lishi ham mumkin. Hujayra kulturasininglatent virusli infektsiyasida virus reproduktsiyalanadi, lekin sitopatik ta'sir kuzatilmaydi. Hujayra transformatsiyasihujayra kulturalarini onkogen viruslar bilan zararlaganda yuzaga keladi, bunda virus ta'sirida hujayralar to'xtovsiz ko'payadi va bir necha qavat hosil qilib, tartibsiz o'sadi. Bunday kultura yuqtirilgan hayvonlarda xavfli o'smalar paydo bo'lishi mumkin. Sitopatik tasirga ko'ra virusni indikatsiya kilish. Bemordan olingan materialda virusni aniqlash maqsadida tekshiriluvchi material bir qavatli hujayra kulturasiga yuqtiriladi. Yuqtirish uchun hujayra katlami tekis usgan probirkalardan foydalaniladi. Ularni mikroskopning kichik ob'ektivida ko'riladi. Zararlashdan oldin probirkadan kultura suyuqligi so'rib olinadi, so'ngra 0,1 ml tekshiriluvchi material solinadi va unga oziq muhit (zardobsiz, qo'llab turuvchi) 1ml gacha qo'shiladi. Har bir material sinamasi 4 ta probirkaga solinadi. Nazorat uchun bir necha probirkalar zararlantirilmaydi. Lekin ularga xam oziq muhit qo'shiladi. Probirkalar termostatda, odatda, 37S da saqlanadi va har kuni sitopatik tasirni aniqlash maqsadida mikroskopda ko'riladi (1hafta mobaynida va undan ham ko'proq). 5- rasm. Virusning sitopatik ta'siri. Morfologik o'zgargan hujayralarning mikroskop ostida ko'rinishi. Simplastlar hosil bo'lishi. O'tkir virusli infektsiyalarda sitopatik tasirning boshqa ko'rinishi kuzatilishi mumkin. Bunda gigant ko'p yadroli hujayralar – simplastlar (yoki sintsitiylar) hosil bo'ladi. 20 turdan ortiq viruslar simplastlar hosil qiladi. Ular o'zida letsitinaza, neyraminidaza va lipidlarga boy fermentlar tutadi (asosan paramiksoviruslar). Fermentlar bir qavatli kultura hujayralarining qobig'iga tasir qiladi va hujayralarning qo'shilib ko'p yadroli sintsitiylar hosil qilishga olib keladi. Kiritmalar. Viruslar sitopatik tasirining ko'rinishiga hujayra ichi kiritmalarining hosil bo'lishi ham kiradi. Agar virus hujayralarni nobud qilmasa, kiritmalar hosil bo'ladi yoki bo'lmasa ularning halok bo'lish bosqichiga yaqin hosil bo'ladi. Kiritmalarning hosil bo'lishi virusga qarshi hujayra reaktsiyasining yagona ko'rinishi bo'lishi ham mumkin. Hujayra kulturasininglatent virusli infektsiyasida virus reproduktsiyalanadi, lekin sitopatik ta'sir kuzatilmaydi. Hujayra transformatsiyasihujayra kulturalarini onkogen viruslar bilan zararlaganda yuzaga keladi, bunda virus ta'sirida hujayralar to'xtovsiz ko'payadi va bir necha qavat hosil qilib, tartibsiz o'sadi. Bunday kultura yuqtirilgan hayvonlarda xavfli o'smalar paydo bo'lishi mumkin. Sitopatik tasirga ko'ra virusni indikatsiya kilish. Bemordan olingan materialda virusni aniqlash maqsadida tekshiriluvchi material bir qavatli hujayra kulturasiga yuqtiriladi. Yuqtirish uchun hujayra katlami tekis usgan probirkalardan foydalaniladi. Ularni mikroskopning kichik ob'ektivida ko'riladi. Zararlashdan oldin probirkadan kultura suyuqligi so'rib olinadi, so'ngra 0,1 ml tekshiriluvchi material solinadi va unga oziq muhit (zardobsiz, qo'llab turuvchi) 1ml gacha qo'shiladi. Har bir material sinamasi 4 ta probirkaga solinadi. Nazorat uchun bir necha probirkalar zararlantirilmaydi. Lekin ularga xam oziq muhit qo'shiladi. Probirkalar termostatda, odatda, 37S da saqlanadi va har kuni sitopatik tasirni aniqlash maqsadida mikroskopda ko'riladi (1hafta mobaynida va undan ham ko'proq).
Hujayra qavatidagi degenerativ o'zgarishlarikkita plyusdan («++»)kam bo'lmagan holatlarda tekshiriluvchi materialda virus bor deb hisoblanadi. Har bir virusninghujayra kulturalarigatsitopatik ta'siri (agar turli turdagi kulturalar bo'lsa ham) ma'lum bir maxsuslikka egadir. Odatda qarindosh bo'lgan viruslarningtsitopatik ta'siri o'xshash bo'ladi, turli xususiyatga ega bo'lgan viruslar sitopatik ta'siri esa, bir-biridan farqqiladi. Shu tufaylitsitopatik ta'siriga ko'ra tekshiriluvchi virusning qaysi oilaga yoki turga kirishi haqida xulosa qilish mumkin. Masalan, enteroviruslar (poliomiyelit virusi, Koksaki, YeSNO) sitopatik tasiriga hujayralarning mayda donador destruktsiyasi xarakterli bulib, bunda hujayralar dumaloq shaklni oladi va bir xil tartibda joylashadi. Adenoviruslar sitopatik ta'siri uchun hujayra qavatining mayda, dumalok hujayralar to'plamiga aylanishi xarakterli bo'lib, hujayralar uzum shingiliga o'xshab joylashadi. Paragripp viruslar, respirator - sintsitial, qizamiq va tepki viruslarining sitopatik tasiri simplastlar hosil bo'lishi bilan kechadi. Sitopatik ta'siriga ko'ra viruslarni titrlash.Tekshiriluvchi materialdagivirusning miqdori titrlash yordamida aniqlanadi. Buninguchun virusning ketma-ket10 martagacha suyultirilgan eritmalari tayyorlanib olinadi vabu suyultirilmalar bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi (har bir suyultirilma uchun 4 tadan probirka olinadi). Sitopatik tasiri bo'yicha virusni titrlash uslubi yuqorida keltirilgan sitopatik ta'siri bo'yicha virusni aniqlash usullaridan deyarli farqqilmaydi. Virusning titri deb, zararlangan kulturaning yarmidatsitopatik ta'sir chaqiradigan virusning eng katta suyultirish darajasiga aytiladi (ya'ni virusning 4ta probirkadagi suyultirilmasidanhech bo'lmaganda ikkitasidatsitopatik ta'sir kuzatilishi lozim). Virusning titri Rid va Mench usuli bo'yicha aniqlanadi.Virusning titri 1 mldagi sitopatik dozalarda ko'rsatiladi(TSPT50). BirTSPT50uchun titrlab suyultirilgan 0,1 ml virus tutuvchi materialqabul qilingan. Ajratib olingan virusni sitopatik ta'sirini neytrallash bo'yicha identifikatsiyalash. Probirkadagi hujayra kulturasiga tekshiriluvchi material yuqtiriladi, sitopatik ta'sir ko'rsatgandan so'ng probirkadagi hujayra suyuqligi identifikatsiyalash uchun virus saqlovchi material sifatida olinadi. Hujayra qavatidagi degenerativ o'zgarishlarikkita plyusdan («++»)kam bo'lmagan holatlarda tekshiriluvchi materialda virus bor deb hisoblanadi. Har bir virusninghujayra kulturalarigatsitopatik ta'siri (agar turli turdagi kulturalar bo'lsa ham) ma'lum bir maxsuslikka egadir. Odatda qarindosh bo'lgan viruslarningtsitopatik ta'siri o'xshash bo'ladi, turli xususiyatga ega bo'lgan viruslar sitopatik ta'siri esa, bir-biridan farqqiladi. Shu tufaylitsitopatik ta'siriga ko'ra tekshiriluvchi virusning qaysi oilaga yoki turga kirishi haqida xulosa qilish mumkin. Masalan, enteroviruslar (poliomiyelit virusi, Koksaki, YeSNO) sitopatik tasiriga hujayralarning mayda donador destruktsiyasi xarakterli bulib, bunda hujayralar dumaloq shaklni oladi va bir xil tartibda joylashadi. Adenoviruslar sitopatik ta'siri uchun hujayra qavatining mayda, dumalok hujayralar to'plamiga aylanishi xarakterli bo'lib, hujayralar uzum shingiliga o'xshab joylashadi. Paragripp viruslar, respirator - sintsitial, qizamiq va tepki viruslarining sitopatik tasiri simplastlar hosil bo'lishi bilan kechadi. Sitopatik ta'siriga ko'ra viruslarni titrlash.Tekshiriluvchi materialdagivirusning miqdori titrlash yordamida aniqlanadi. Buninguchun virusning ketma-ket10 martagacha suyultirilgan eritmalari tayyorlanib olinadi vabu suyultirilmalar bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi (har bir suyultirilma uchun 4 tadan probirka olinadi). Sitopatik tasiri bo'yicha virusni titrlash uslubi yuqorida keltirilgan sitopatik ta'siri bo'yicha virusni aniqlash usullaridan deyarli farqqilmaydi. Virusning titri deb, zararlangan kulturaning yarmidatsitopatik ta'sir chaqiradigan virusning eng katta suyultirish darajasiga aytiladi (ya'ni virusning 4ta probirkadagi suyultirilmasidanhech bo'lmaganda ikkitasidatsitopatik ta'sir kuzatilishi lozim). Virusning titri Rid va Mench usuli bo'yicha aniqlanadi.Virusning titri 1 mldagi sitopatik dozalarda ko'rsatiladi(TSPT50). BirTSPT50uchun titrlab suyultirilgan 0,1 ml virus tutuvchi materialqabul qilingan. Ajratib olingan virusni sitopatik ta'sirini neytrallash bo'yicha identifikatsiyalash. Probirkadagi hujayra kulturasiga tekshiriluvchi material yuqtiriladi, sitopatik ta'sir ko'rsatgandan so'ng probirkadagi hujayra suyuqligi identifikatsiyalash uchun virus saqlovchi material sifatida olinadi.
Tajribani qo'yish uchun kultural suyuqlik (virusningma'lum SPD 50 dozasi bilan) diagnostik immun zardob bilan teng miqdorda aralashtiriladi (zardobning 1:5 yoki 1:10 suyultirilmalari olinadi). Xona haroratida 1-2 soat turgandan so'ng,bu aralashma bilan (0,2 ml dan) oldindan oziq muhitito'kib tashlangan4 ta probirkadagihujayra kulturasi zararlantiriladi; aralashma qo'shilgandan so'ng probirkaga 0,8ml dan yangi oziq muhit kuyiladi. Odatda, kultural suyuqlik sinamasi bir vaqtda bir nechta turga xos zardoblar bilan tekshiriladi. Tajriba bir nechta nazoratlar bilan olib boriladi: • Zararlanmagan kultura nazorati; • Virus dozasining nazorati — hujayra kulturalari tajribadagidek virus dozasi bilan zararlantiriladi; • Kultural suyuqlik va me'yoriy zardob aralashmasi bilan zararlangan kultura nazorati. Tajriba natijasi 5-7 va undan ko'prok kundan so'ng, probirkalarni mikroskopning kichik ob'ektivi ostida ko'rish bilan baholanadi. Birinchi nazoratda SPT bo'lmasligi kerak, ikkinchi va uchinchisida albatta SPT hosil bo'lishi kerak. Tajriba probirkalarida sitopatik ta'sirning bo'lmasligi bu probirkada virusning immun zardob bilan neytralizatsiyasi sodir bo'lganligidan dalolat beradi, bundan tashqari zardob ajratib olingan virus turiga mos keladi. Shunga o'xshash tarzda bemor zardobida virusneytrallovchi antitelalarni titrlash ham olib boriladi. Tekshirilayotgan zardobning ikki marotaba suyultirilgan darajalari tayyorlanadi va ularning har biri ma'lum virusning standart dozalari (100, 1000 SPD50) bilan aralashtiriladi, 1-2 soatlik inkubatsiyadan so'ng aralashma bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi. Zardob titri deb, tajribaga olingan kulturalarning yarmida virusning sitopatik ta'sirini butunlay yo'qotgan eng katta suyultirish darajasiga aytiladi (zardobning har bir suyultirish darajasi tekshiriladigan 4 ta probirkadan 2 tasida). Gemadsorbtsiya reaktsiyasi Tajribani qo'yish uchun kultural suyuqlik (virusningma'lum SPD 50 dozasi bilan) diagnostik immun zardob bilan teng miqdorda aralashtiriladi (zardobning 1:5 yoki 1:10 suyultirilmalari olinadi). Xona haroratida 1-2 soat turgandan so'ng,bu aralashma bilan (0,2 ml dan) oldindan oziq muhitito'kib tashlangan4 ta probirkadagihujayra kulturasi zararlantiriladi; aralashma qo'shilgandan so'ng probirkaga 0,8ml dan yangi oziq muhit kuyiladi. Odatda, kultural suyuqlik sinamasi bir vaqtda bir nechta turga xos zardoblar bilan tekshiriladi. Tajriba bir nechta nazoratlar bilan olib boriladi: • Zararlanmagan kultura nazorati; • Virus dozasining nazorati — hujayra kulturalari tajribadagidek virus dozasi bilan zararlantiriladi; • Kultural suyuqlik va me'yoriy zardob aralashmasi bilan zararlangan kultura nazorati. Tajriba natijasi 5-7 va undan ko'prok kundan so'ng, probirkalarni mikroskopning kichik ob'ektivi ostida ko'rish bilan baholanadi. Birinchi nazoratda SPT bo'lmasligi kerak, ikkinchi va uchinchisida albatta SPT hosil bo'lishi kerak. Tajriba probirkalarida sitopatik ta'sirning bo'lmasligi bu probirkada virusning immun zardob bilan neytralizatsiyasi sodir bo'lganligidan dalolat beradi, bundan tashqari zardob ajratib olingan virus turiga mos keladi. Shunga o'xshash tarzda bemor zardobida virusneytrallovchi antitelalarni titrlash ham olib boriladi. Tekshirilayotgan zardobning ikki marotaba suyultirilgan darajalari tayyorlanadi va ularning har biri ma'lum virusning standart dozalari (100, 1000 SPD50) bilan aralashtiriladi, 1-2 soatlik inkubatsiyadan so'ng aralashma bilan hujayra kulturalari zararlantiriladi. Zardob titri deb, tajribaga olingan kulturalarning yarmida virusning sitopatik ta'sirini butunlay yo'qotgan eng katta suyultirish darajasiga aytiladi (zardobning har bir suyultirish darajasi tekshiriladigan 4 ta probirkadan 2 tasida). Gemadsorbtsiya reaktsiyasi
Viruslar yuqtirilgan hujayra kulturasiningo'z yuzasiga eritrotsitlarni adsorbtsiya qilish qobiliyati gemadsorbtsiya deb ataladi. Birinchi marotaba bunday ko'rinish gripp virusi yuqtirilgan hujayra kulturasida aniqladi. Keyinchalik gemadsorbtsiyalash xususiyati boshqa ko'pgina viruslarga (masalan, orto- va paramiksoviruslar, flaviviruslar, poksviruslar) ham xos ekanligi aniqlandi, bu viruslar gemagglyutinatsiya qilish, ya'ni eritrotsitlarnibir-biriga yopishtirish xususiyatiga ham ega. Gemadsorbtsiya va gemagglyutinatsiya o'xshash mexanizmlarga ega. Gemadsorbtsiyalash xossasigaega bo'lishi virus yuqtirilgan hujayra membranasida virusga xos maxsus oqsillarning-gemagglyutininlarning joylashganiga bog'liq bo'lib, eritrotsitlardabu oqsillarga komplementar retseptorlar bo'ladi va shuning uchun ham ular zararlangan hujayralar yuzasiga adsorbtsiyalanadi. Reaktsiyada dengiz cho'chqasi, tovuq, maymun, odamning O(I) guruh eritrotsitlari qo'llaniladi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasida, shu virusning gemagglyutinatsiyalovchi ta'siriga sezgir bo'lgan, eritrotsitlar ko'pincha faolhisoblanadi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasida virusni aniqlash. Virus yuqtirilgan hujayralar sitopatik o'zgarishlar kelib chiqmasdan ancha oldin gemadsorbtsiyalash qobiliyatiga ega bo'ladi. Shuning uchun ham zararlangan hujayralarda virusni erta aniqlash uchun gemadsorbtsiya reaktsiyasidanfoydalanish mumkin.TSitopatik ta'sir sust rivojlangan yoki butunlay kuzatilmagan latent infektsiyalardahujayra kulturasida virus bor-yo'qligi gemadsorbtsiya reaktsiyasi orqali aniqlaniladi. Hujayra kulturasida latent infektsiyani adenoviruslar, paragripp, gerpesviruslari va boshqalar keltirib chiqaradi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasining qo'yilish texnikasi.Yuqorida ko'rsatib o'tilgan usul bo'yicha tekshiriluvchi material hujayra kulturasiga yuqtiriladi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi har ikki kunda, musbat reaktsiya kuzatilguncha qo'yiladi (8-10 kun davomida). Buning uchun probirkadagi yuqtirilgan kulturaga (ba'zida oldindan muhit olib tashlanadi) 0,2 ml dan eritrotsitlar yig'ilmasi solinadi (0,4-1,0%) va eritrotsitlar hujayra qavatiga tegib turishi uchun probirka qiya holatida qo'yiladi. Tajribani qo'yishda virus turiga qarab harorat va ekspozitsiya vaqti belgilanadi. Viruslar yuqtirilgan hujayra kulturasiningo'z yuzasiga eritrotsitlarni adsorbtsiya qilish qobiliyati gemadsorbtsiya deb ataladi. Birinchi marotaba bunday ko'rinish gripp virusi yuqtirilgan hujayra kulturasida aniqladi. Keyinchalik gemadsorbtsiyalash xususiyati boshqa ko'pgina viruslarga (masalan, orto- va paramiksoviruslar, flaviviruslar, poksviruslar) ham xos ekanligi aniqlandi, bu viruslar gemagglyutinatsiya qilish, ya'ni eritrotsitlarnibir-biriga yopishtirish xususiyatiga ham ega. Gemadsorbtsiya va gemagglyutinatsiya o'xshash mexanizmlarga ega. Gemadsorbtsiyalash xossasigaega bo'lishi virus yuqtirilgan hujayra membranasida virusga xos maxsus oqsillarning-gemagglyutininlarning joylashganiga bog'liq bo'lib, eritrotsitlardabu oqsillarga komplementar retseptorlar bo'ladi va shuning uchun ham ular zararlangan hujayralar yuzasiga adsorbtsiyalanadi. Reaktsiyada dengiz cho'chqasi, tovuq, maymun, odamning O(I) guruh eritrotsitlari qo'llaniladi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasida, shu virusning gemagglyutinatsiyalovchi ta'siriga sezgir bo'lgan, eritrotsitlar ko'pincha faolhisoblanadi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasida virusni aniqlash. Virus yuqtirilgan hujayralar sitopatik o'zgarishlar kelib chiqmasdan ancha oldin gemadsorbtsiyalash qobiliyatiga ega bo'ladi. Shuning uchun ham zararlangan hujayralarda virusni erta aniqlash uchun gemadsorbtsiya reaktsiyasidanfoydalanish mumkin.TSitopatik ta'sir sust rivojlangan yoki butunlay kuzatilmagan latent infektsiyalardahujayra kulturasida virus bor-yo'qligi gemadsorbtsiya reaktsiyasi orqali aniqlaniladi. Hujayra kulturasida latent infektsiyani adenoviruslar, paragripp, gerpesviruslari va boshqalar keltirib chiqaradi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasining qo'yilish texnikasi.Yuqorida ko'rsatib o'tilgan usul bo'yicha tekshiriluvchi material hujayra kulturasiga yuqtiriladi. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi har ikki kunda, musbat reaktsiya kuzatilguncha qo'yiladi (8-10 kun davomida). Buning uchun probirkadagi yuqtirilgan kulturaga (ba'zida oldindan muhit olib tashlanadi) 0,2 ml dan eritrotsitlar yig'ilmasi solinadi (0,4-1,0%) va eritrotsitlar hujayra qavatiga tegib turishi uchun probirka qiya holatida qo'yiladi. Tajribani qo'yishda virus turiga qarab harorat va ekspozitsiya vaqti belgilanadi.
Poksviruslar, kanali entsefalit viruslari bilan reaktsiya qo'yishda tajriba 15-30 daqiqa davomida xona haroratida o'tkaziladi. Orto- va paramiksoviruslar bilan o'tkaziladigan reaktsiyadaekspozitsiya uchun 3-5 daqiqa yetarli hisoblanadi.Keyinchalik probirkalar sekin chayqatiladi va adsorbtsiya bo'lmagan eritrotsitlar cho'kishi uchun vertikal holatda ma'lum bir vaqt qoldiriladi. Mikroskopning kichkina ob'ektivida tajriba probirkalarida musbat gemadsorbtsiya reaktsiyasi qayd qilinadi, bunda eritrotsitlar hujayra qavatiga yopishgan holda hujayra kulturasiga adsorbtsiyalanadi; nazorat probirkada hujayra qavatida eritrotsitlar yopishmaganligi kuzatiladi. Gemadsorbtsiya musbat bo'lganda hujayralarda eritrotsitlarning yig'ilishi har xil bo'lishi mumkin. Gripp virusida gemadsorbtsiya orolcha shaklida kuzatilsa, paragripp viruslarida - diffuz (tarqoq) holatda;poksviruslar uchun eritrotsitlarning hujayra atrofida aylanasimon, ya'ni marjon shodasidekjoylashishi xarakterlidir. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi kasalning burun-halqumidan olingan yuvindida paragripp viruslarini erta aniqlash uchun ko'p qo'llaniladi. Bundan tashqari, bu reaktsiya viruslarni titrlash va maxsus antitelolarni aniqlash uchun ham qo'llaniladi (6-rasm). Poksviruslar, kanali entsefalit viruslari bilan reaktsiya qo'yishda tajriba 15-30 daqiqa davomida xona haroratida o'tkaziladi. Orto- va paramiksoviruslar bilan o'tkaziladigan reaktsiyadaekspozitsiya uchun 3-5 daqiqa yetarli hisoblanadi.Keyinchalik probirkalar sekin chayqatiladi va adsorbtsiya bo'lmagan eritrotsitlar cho'kishi uchun vertikal holatda ma'lum bir vaqt qoldiriladi. Mikroskopning kichkina ob'ektivida tajriba probirkalarida musbat gemadsorbtsiya reaktsiyasi qayd qilinadi, bunda eritrotsitlar hujayra qavatiga yopishgan holda hujayra kulturasiga adsorbtsiyalanadi; nazorat probirkada hujayra qavatida eritrotsitlar yopishmaganligi kuzatiladi. Gemadsorbtsiya musbat bo'lganda hujayralarda eritrotsitlarning yig'ilishi har xil bo'lishi mumkin. Gripp virusida gemadsorbtsiya orolcha shaklida kuzatilsa, paragripp viruslarida - diffuz (tarqoq) holatda;poksviruslar uchun eritrotsitlarning hujayra atrofida aylanasimon, ya'ni marjon shodasidekjoylashishi xarakterlidir. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi kasalning burun-halqumidan olingan yuvindida paragripp viruslarini erta aniqlash uchun ko'p qo'llaniladi. Bundan tashqari, bu reaktsiya viruslarni titrlash va maxsus antitelolarni aniqlash uchun ham qo'llaniladi (6-rasm).
6-rasm. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi Gemadsorbtsiyani to'xtatish reaktsiyasida viruslarni identifikatsiyalash. Shu aniqlandiki,virus yuqtirilgan probirkadagihujayra kulturasiga maxsus immun zardoblar qo'shilganda, hujayralar eritrotsitlarni adsorbtsiyalash qobiliyatini yo'qotadi, ya'ni gemadsorbtsiyani to'xtatish holati kuzatiladi. Bu holatga maxsuslik xos bo'lganiuchun gemadsorbtsiyani to'xtatish reaktsiyasidan ajratib olingan viruslarni identifikatsiyalashda, bundan tashqari kasal zardobidagi virusni- neytrallovchi antitelolarni aniqlash va titrlashda ham foydalanish mumkin. Pilakchalar usuli Virus ta'siri natijasida bir qavatli kultura hujayralarining buzilgan, parchalangan joylariga pilakchalar deyiladi. Bu viruslarning o'ziga xos “negativ koloniya” lari bo'lib, bitta virion tushgan joyda hosil bo'ladi. Pilakchalar hosil qilish uchun bir qavatli xujayralargakamroq kontsentratsiyali virus yuqtiriladi va hujayraga adsorbtsiyalangan viruslar agarli qavat (yopqich) bilan fiksatsiyalanadi. Bu agar tarkibiga vital bo'yoq- neytral qizil qo'shilgan bo'ladi. Bunday sharoitda viruslarning SPT o'choqli (ochagovыy) ko'rinishda bo'lib, o'lgan hujayralar degeneratsiyalanadi, neytral qizil bo'yog'ini ushlab qolish qobiliyatini yo'qotadi va rangsizlanadi. Natijada hujayra qavatining tiniq bo'lmagan pushti rangli fonida tiniq, bo'yalmagan,aylanasimon dog' ko'rinishida pilakchalar hosil bo'ladi. Birinchi bo'lib bir qavatli hujayra kulturalarida poliomiyelit virusining pilakchalari aniqlangan. Bunda hujayra kulturasi Petri kosachasida 3% SO2saqlagan steril havoli termostatda o'stirilgan (Dyulbekko, 1962). Hozirgi vaqtda pilakchalar rezina tiqin bilan yopilgan yassi flakonlar-matratslarda, ba'zan leykoplastыr bilan germetik yopilgan Petri kosachalarida olinmoqda. 6-rasm. Gemadsorbtsiya reaktsiyasi Gemadsorbtsiyani to'xtatish reaktsiyasida viruslarni identifikatsiyalash. Shu aniqlandiki,virus yuqtirilgan probirkadagihujayra kulturasiga maxsus immun zardoblar qo'shilganda, hujayralar eritrotsitlarni adsorbtsiyalash qobiliyatini yo'qotadi, ya'ni gemadsorbtsiyani to'xtatish holati kuzatiladi. Bu holatga maxsuslik xos bo'lganiuchun gemadsorbtsiyani to'xtatish reaktsiyasidan ajratib olingan viruslarni identifikatsiyalashda, bundan tashqari kasal zardobidagi virusni- neytrallovchi antitelolarni aniqlash va titrlashda ham foydalanish mumkin. Pilakchalar usuli Virus ta'siri natijasida bir qavatli kultura hujayralarining buzilgan, parchalangan joylariga pilakchalar deyiladi. Bu viruslarning o'ziga xos “negativ koloniya” lari bo'lib, bitta virion tushgan joyda hosil bo'ladi. Pilakchalar hosil qilish uchun bir qavatli xujayralargakamroq kontsentratsiyali virus yuqtiriladi va hujayraga adsorbtsiyalangan viruslar agarli qavat (yopqich) bilan fiksatsiyalanadi. Bu agar tarkibiga vital bo'yoq- neytral qizil qo'shilgan bo'ladi. Bunday sharoitda viruslarning SPT o'choqli (ochagovыy) ko'rinishda bo'lib, o'lgan hujayralar degeneratsiyalanadi, neytral qizil bo'yog'ini ushlab qolish qobiliyatini yo'qotadi va rangsizlanadi. Natijada hujayra qavatining tiniq bo'lmagan pushti rangli fonida tiniq, bo'yalmagan,aylanasimon dog' ko'rinishida pilakchalar hosil bo'ladi. Birinchi bo'lib bir qavatli hujayra kulturalarida poliomiyelit virusining pilakchalari aniqlangan. Bunda hujayra kulturasi Petri kosachasida 3% SO2saqlagan steril havoli termostatda o'stirilgan (Dyulbekko, 1962). Hozirgi vaqtda pilakchalar rezina tiqin bilan yopilgan yassi flakonlar-matratslarda, ba'zan leykoplastыr bilan germetik yopilgan Petri kosachalarida olinmoqda.
Yopqich muhit.Agarli yopqichlar 1-1,5% kontsentratsiyali yuqorisifatli agar va boshqa komponentlar-tuzli buferli eritmalar, qo'shimcha oziq moddalar, antibiotiklardan tayyorlanadi.Neytral qizil bo'yoq eritmasi muhit tarkibida bo'ladi yoki uni flakonga yoki Petri kosachasiga tajribaning natijasi hisobga olinishidan sal avvalroq qo'shiladi. Hujayra kulturasining va virusning turini qarab, qo'llaniladigan yopqich muhitlarning har xil retseptlari bor. Oxirgi vaqtlarda agar o'rniga bentionit geli (5-6%) qo'shilgan yopqich muhitlar samarali qo'llanilmoqda. Bu alyumosilikatning kelib chiqishi tabiiy bo'lib, biologik inert va hujayra kulturasiga zaharli ta'siri yo'q. Bentionitli yopqich muhit ostida pilakchalar yaxshi ko'rinadi. Pilakcha usulida viruslarni aniqlash va titrlash.Viruspilakchalarini hosil qilish uchun flakonlarga yoki kosachalarga oziq muhitdagi (№199 muhiti yoki gidrolizat albuminli muhit) hujayralar yig'ilmasi quyiladi. Flakonlar rezina tiqin bilan yopiladi, kosachalarga leykoplastirlar yopishtiriladi va bir qavatli hujayralarni olish uchun 5- 6 kunga termostatga qo'yiladi. Bu hujayralar qavati to'liq o'sgan bo'lishi va degeneratsiya belgilari bo'lmasligi lozim. Yuqtirishdan oldin flakon yoki kosachalardagi muhit olib tashlanadi va bir qavatli hujayra kulturasi ehtiyotlik bilan Xenks eritmasida yuviladi, so'ngra bu eritma so'rib olib tashlanadi. Suyultirilgan tekshiriluvchi material 0,1-0,25 ml hajmda hujayra qavatiga yuqtiriladi va chayqatish yo'li bilan hujayra qavati yuzasiga bir tekisda tarqatiladi. 30-60 daqiqadan so'ng zararlangan hujayra kulturasiga yopqich muhit quyiladi. Muhit qotgandan so'ng flakonlar va kosachalar termostatga qo'yiladi (hujayra qavati yuqoriga qilib) va pilakchalar hosil bo'lguncha ushlanadi (2-5 kun), keyinchalik ular o'rganiladi va baholanadi. Virus tutuvchi materialni suyultirish darajasi bilan hosil bo'lgan pilakchalar soni orasida proportsional bog'liqlikmavjud bo'lib, bundan bilish mumkinki, bitta virionning hujayrada ko'payishi natijasida bitta pilakcha hosil bo'ladi. Hozirgi vaqtda ko'plab viruslarning pilakchalar hosil qilish xususiyati aniqlandi: poliomiyelit, Koksaki, YeSNO, entsefalit, gripp, qizamiq va boshqalar. Yopqich muhit.Agarli yopqichlar 1-1,5% kontsentratsiyali yuqorisifatli agar va boshqa komponentlar-tuzli buferli eritmalar, qo'shimcha oziq moddalar, antibiotiklardan tayyorlanadi.Neytral qizil bo'yoq eritmasi muhit tarkibida bo'ladi yoki uni flakonga yoki Petri kosachasiga tajribaning natijasi hisobga olinishidan sal avvalroq qo'shiladi. Hujayra kulturasining va virusning turini qarab, qo'llaniladigan yopqich muhitlarning har xil retseptlari bor. Oxirgi vaqtlarda agar o'rniga bentionit geli (5-6%) qo'shilgan yopqich muhitlar samarali qo'llanilmoqda. Bu alyumosilikatning kelib chiqishi tabiiy bo'lib, biologik inert va hujayra kulturasiga zaharli ta'siri yo'q. Bentionitli yopqich muhit ostida pilakchalar yaxshi ko'rinadi. Pilakcha usulida viruslarni aniqlash va titrlash.Viruspilakchalarini hosil qilish uchun flakonlarga yoki kosachalarga oziq muhitdagi (№199 muhiti yoki gidrolizat albuminli muhit) hujayralar yig'ilmasi quyiladi. Flakonlar rezina tiqin bilan yopiladi, kosachalarga leykoplastirlar yopishtiriladi va bir qavatli hujayralarni olish uchun 5- 6 kunga termostatga qo'yiladi. Bu hujayralar qavati to'liq o'sgan bo'lishi va degeneratsiya belgilari bo'lmasligi lozim. Yuqtirishdan oldin flakon yoki kosachalardagi muhit olib tashlanadi va bir qavatli hujayra kulturasi ehtiyotlik bilan Xenks eritmasida yuviladi, so'ngra bu eritma so'rib olib tashlanadi. Suyultirilgan tekshiriluvchi material 0,1-0,25 ml hajmda hujayra qavatiga yuqtiriladi va chayqatish yo'li bilan hujayra qavati yuzasiga bir tekisda tarqatiladi. 30-60 daqiqadan so'ng zararlangan hujayra kulturasiga yopqich muhit quyiladi. Muhit qotgandan so'ng flakonlar va kosachalar termostatga qo'yiladi (hujayra qavati yuqoriga qilib) va pilakchalar hosil bo'lguncha ushlanadi (2-5 kun), keyinchalik ular o'rganiladi va baholanadi. Virus tutuvchi materialni suyultirish darajasi bilan hosil bo'lgan pilakchalar soni orasida proportsional bog'liqlikmavjud bo'lib, bundan bilish mumkinki, bitta virionning hujayrada ko'payishi natijasida bitta pilakcha hosil bo'ladi. Hozirgi vaqtda ko'plab viruslarning pilakchalar hosil qilish xususiyati aniqlandi: poliomiyelit, Koksaki, YeSNO, entsefalit, gripp, qizamiq va boshqalar.