VIRUSLARNI TOVUQ EMBRIONIGA YUQTIRISH Mashg'ulot o'tkazish joyi, jixozlanishi: Mikrobiologiya kafedrasi auditoriyalari va laboratoriyasi. Labaratoriya mashg'ulot o'tkazish uchun: virus tutuvchi material, mikroskoplar, pipetkalar, probirkalar, spirt lampalari, buyum oynachalari, bakterial qovuzloq, shtativlar. 2. Mashg'ulotning davomiyligi: 2 soat 3. Mashg'ulotning maqsadlari: Talabalarni viruslarni tuzilishi va kimyoviy tarkibi, kupayishi, laboratoriyada ajratib olinishi, indikatsiya, identifikatsiya qilish usullari bilan tanishtirish. Vazifalar: Talabalar bilishi lozim: DNK va RNK tutuvchi viruslar xaqida (ularni strukturasini, simmetriya tiplari, ximiyaviy tarkibi). Viruslik laboratoriya kullaniladigan, xujayra kulьturasini va ularni ochish printsiplari. Viruslarni xujayraga ta'siri va ularni aniqlash usullari. Virusli yukumli kasalliklarga tashxis qo'yish usullari. Talabalar kila olishi kerak: Virus saklovchi patologik matirialni xujayra kulьturasiga yuktirishi. Kasalning burin xalkumidan olingan yuvindini tovuq embirioni amnion bushligiga va allontois suyukligiga yuktirish. № Bajariladigan tadbirlar Bajara bilmadi (ball) To'liq bajardi (ball) 1 Tuxum taglikka vertikal joylashtiriladi, bunda havo bo'shlig'i yuqoriga qaragan holatda bo'ladi; tuxumning to'mtoq uchi puxtalik bilan sterillanadi. 2 Havo bo'shlig'i markazidan preparatlash ninasi yordamida po'stloq teshiladi. 0 10 3 Hosil qilingan teshikdan qaychi uchi kiritilib po'stloqda diametri 1,5 sm bo'lgan tuynuk ochiladi (bunda po'stloqning tuxum ichiga tushishiga yo'l qo'ymaslik kerak). 0 10 4 Teshik orqali po'stloq qobig'ining ichki varag'i ko'rinib turadi, uni extiyotkorlik bilan pintset yoki igna yordamida tilinib, xorionallantois qobig'ini ochish uchun ma'lum qismi (0,5 – 1sm2) ko'chiriladi. 0 10 5 Xorionallantois qobig'iga virus yuqtirish uchun 0,1 – 0,2 ml virus saqlovchi material (masalan, chechak virusi) paster pipetkasi yoki shprits yordamida yuboriladi. 0 10 6 Po'stloqdagi teshik maxsus elastik plenka, steril yopqich oyna yoki shisha qalpoqcha bilan yopiladi. Yopqich oyna va qalpoqchani po'stloqqa mustahkamlash Virus yuktirilgan embrion vertikal holatda 2 – 3 sutkaga termostatga qo'yiladi, shundan so'ng quyidagi tartibda kesib ochiladi: 0 10 7 Tuxum taglikka vertikal havo kamerasi yuqoriga qaratilgan holatda o'rnatiladi va kesiladigan yuza yuqorida keltirilgandek yod va spirt bilan ishlov berib sterillanadi. 0 10 8 Plyonka, yopqich oyna yoki qalpoqcha olib tashlanib, steril qaychi yordamida po'stloq havo bo'shlig'i chegarasidan kesiladi. 0 10 9 Pintset yordamida po'stloq qobig'i olib tashlanadi. Ochilgan xorionallantois qobig'i bo'ylamasiga kesiladi. Hosil bo'lgan teshik orqali tuxumning ichki qismi kosachaga yoki lotokka quyib olinadi. 0 10 10 Po'stloq ichida qolgan xorionallantois pardasi pintset yordamida shilib olinib fiziologik eritmali steril kosachaga solinadi. Tekislanib, kosachani qora fonga qo'yib, hosil bo'lgan o'zgarishlar o'rganiladi. 0 10 JAMI 0 100 4. Mavzuni asoslash: Viruslarni tovuq embrionida o'stirish virusologiyada virusni infektsion materialdan birlamchi ajratib olishda va keyinchalik passaj yo'li bilan ularni o'stirishda keng qo'llaniladi. Virusni tovuq embrionida o'stirish usulidan virusli infektsiyalarga tashhis qo'yishda va ilmiy tadiqotlarda foydalaniladi. Bu usul yordamida, vaktsina va diagnostik preperatlar tayyorlash uchun,juda ko'p miqdorda virus saqlovchi material olinadi. Odam va hayvonlarni zararlovchi ko'pgina viruslarning tovuq embrionida yuqori yoki past darajada ko'payish mumkinligi aniqlangan. Qattiq po'stloq embrionni himoya qilib, unga tashqi muhitdan mikroorganizmlar tushishiga to'siqlik qiladi, bu esa viruslarni steril sharoitda ko'payishiga sharoit yaratadi. Embrion latent viruslardan holi bo'lib, bu bilan laboratoriya hayvonlaridan ustun turadi. Bu usulning kamchiliklari quyidagilar: 1. Virus bilan zararlagandan so'ng embriondagi patologik o'zgarishlarni dinamikada kuzatish imkoniyati yo'q; 2. Virus bilan zararlangan embrion ochilganda o'zgarishlarni ko'z bilan ko'rib bo'lmaydi, shuning uchun embriondagi embrion suyuqligidagi virusni aniqlash maqsadida boshqa virusologik usullarni qo'llashga to'g'ri keladi. (Masalan, gemagglyutinatsiya reaktsiyasi) 3. Hayvonlarda yaxshi aniqlash imkoniyati bo'lgan antitelalar 4. Tovuq embrionida viruslarni o'stirish usulini hamma viruslar uchun qo'llab bo'lmaydi, ya'ni bu usul universal emas. Bunday kamchiliklarning borligiga qaramasdan tovuq embrionida virusni o'stirish usuli oson, qulay va arzon bo'lib, virusologiya amaliyotida keng qo'llaniladi. Ayniqsa, ortomiksoviruslar, gerpesviruslar va poks- viruslar bilan ishlaganda bu usulning ahamiyati katta. Tovuq embrionining tuzilishi. Tovuqembrioni ohaklangan qobiq po'st bilan qoplangan bo'lib, uning ichki tomoniga bu qobiq alohida havo bo'shlig'i hosil qiladi. Po'stloq qobig'i ostida xorionallantois qobig'i bo'lib tuxumning to'mtoq uchida po'stloq qobig'iga o'tadi. Bu qobiq qon tomirlarga boy bulib, embrionning nafas olish organi vazifasini bajaradi. Uning ichki tomonida allantois bo'shlig'i joylashib, u ajratish organi vazifasini bajaradi va murtakni qurib kolish va turli ta'sirotlardan himoya qiladi. Allantois bo'shlig'i amnion suyuqligi bilan to'lgan amnion bo'shlig'ida joylashgan murtak atrofini o'rab turadi. Murtak sariqlik ipi orqali asosiy oziq manbai bo'lgan sariqlik xaltachasi bilan bog'langan. Rivojlanishning kechki bosqichlarida embrion oziq moddalarni tuxumning o'tkir uchida joylashgan oqsil xaltachasidan oladi. 4-rasm. Tovuq embrioning tuzilishi (inkubatsiyaning 9 kuni) Ishga tayyorgarlik. Rivojlanayotgan tovuq embrionida virusni o'stirish uchun ma'lum tartibdagi harorat (odamda 36 – 38°S), namlik (50 – 70%), shuningdek yetarlicha ventilyatsiya zarur. Virus turi va uni yuqtirish usulidan qat'iy nazar, tovuq embrioniga virusni yuqtirish inkubatsiyadagi tuxumning 6 kundan 13 kungacha bo'lgan muddatlarida amalga oshiriladi (4-rasm). Ilmiy ulanish maqsadi va virus xususiyatlarini bilgan holda virusning optimal yuqtirish dozasini va embrionni virus bilan zararlashning to'g'ri usulini tanlay bilish lozim. Barcha operatsiyalar aseptik sharoitda, imkoni boricha bokslarda o'tkaziladi. Ish uchun quyidagilar tayyorlanadi: tuxum uchun taglik, spirtli va yodli sharchalar, steril parafinli probirka, yopqich oynalar, steril paxtali qopcha, doka, qog'oz bilan o'ralgan steril idish, steril shpritslar, ignalar, pintsetlar, preparat ignalari. Asboblar butun ish davomida spirtli stakanga solingan holatda bo'lib, har bir o'tkazilgan manipulyatsiyadan so'ng gorelka alangasida qizdirib sterillanadi. Ish boshlashdan oldin qo'llar yaxshilab yuviladi va dokadan tayyorlangan niqob taqib ishlash tavsiya etiladi. Ish boshlash uchun yashash qobiliyati saqlangan embrion tanlab olinadi, buning uchun maxsus yoritilgan quti – ovoskopda inkubatsiyadagi tuxumdan nur o'tkazib ko'riladi. Yoritilgan tuxum po'sti orqali embrionni, xorionallantois qobiq tomirlarini, havo qopchasi chegarasini ko'rish mumkin. Hayot qobiliyati saqlangan embrion harakatchan bo'lib, qon tomirlari qon bilan to'la bo'ladi. Tuxum po'stlog'ida havo qopchasi chegarasi va embrion holati qalamda chizib belgilanadi. Tanlab olingan tuxumning to'mtoq uchi (yoki tuxumning yon tomoni) yaxshilabdezinfektsiya qilinadi: po'stloq spirt bilan artiladi; yod suriladi; yana spirt bilan artiladi va qoida bo'yicha alangada tutib qizdiriladi. Товук эмбрионида вирусларни ўстириш ва ажратиб олиш вирусни ажратиб олиш вирусни йиғиш вирусни экиш товуқ эмбриони ёши уруғланган товуқ тухуми маълум шароитларда сақлаш намлик 50 80% ҳарорат 37 38°С грипп вируси учун 9 10 кунлик амнион бўшлиғига Хорионаллан- тоис қобиғига аллантоис бўшлиғига грипп ва паротип вирусини ажратиб олиш чечак вакцина вируси келтириб чиқарган ўзгаришларни аниқлаш етарли миқдорда грипп, паротип ва чечак вакцина вирусини олиш товуқ эмбриони юқори даражада чидамликка эга латент вирусли инфекциялардан ҳоли оддий арзон инфекцион жараённи динамикада кузатиб бўлмайди кўп миқдорда оқсил тутади, бу эса вирусларни тозалаб олишда қийинчилик туғдиради кўпгина вирусли инфекцияларда ўзгаришларни кўриб бўлмайди универсал эмас юқтириш мақсади юқтириш шартлари белгиланган шартларни яратиш намуналари вирус хусусиятлари ва мақсадини ҳисобга оган ҳолда юқтириш натижаси усулни бахолаш А. афзаллиги Б. камчилиги Tovuq embrioniga yuqtirish usullari Xorionallantois qobig'iga yuqtirish. Bu usul eng ko'p qo'llaniladigan usullardan biri bo'lib hisoblanadi. Bu usulning afzallik tomoni shundaki, bir qator turdagi viruslar xorionallantois qobig'ida ko'payganda o'ziga xos o'zgarishlarni yuzaga keltiradi, jumladan, turlicha shakldagi oqish pilakcha dog'lar ko'rinishidagi zararlanish o'choqlarini hosil qiladi. Yuqtirish uchun 10 – 12 kunlik embrion olinadi. Odatda xorionallantois qobig'iga yuqtirish uchun havo qopchasi ustidan yoki tuxumning yon tomonidan po'stloq teshiladi. Havoli bo'shliq tomondan xorionallantois qobig'iga yuqtirish usulining asosiy bosqichlari: 1. Tuxum taglikka vertikal joylashtiriladi, bunda havo bo'shlig'i yuqoriga qaragan holatda bo'ladi; tuxumning to'mtoq uchi puxtalik bilan sterillanadi. 2. Havo bo'shlig'i markazidan preparatlash ninasi yordamida po'stloq teshiladi. 3. Hosil qilingan teshikdan qaychi uchi kiritilib po'stloqda diametri 1,5 sm bo'lgan tuynuk ochiladi (bunda po'stloqning tuxum ichiga tushishiga yo'l qo'ymaslik kerak). 4. Teshik orqali po'stloq qobig'ining ichki varag'i ko'rinib turadi, uni extiyotkorlik bilan pintset yoki igna yordamida tilinib, xorionallantois qobig'ini ochish uchun ma'lum qismi (0,5 – 1sm2) ko'chiriladi. 5. Xorionallantois qobig'iga virus yuqtirish uchun 0,1 – 0,2 ml virus saqlovchi material (masalan, chechak virusi) paster pipetkasi yoki shprits yordamida yuboriladi. 6. Po'stloqdagi teshik maxsus elastik plenka, steril yopqich oyna yoki shisha qalpoqcha bilan yopiladi. Yopqich oyna va qalpoqchani po'stloqqa mustahkamlash uchun eritilgan parafindan foydalaniladi. Virus yuktirilgan embrion vertikal holatda 2 – 3 sutkaga termostatga qo'yiladi, shundan so'ng quyidagi tartibda kesib ochiladi: 1. Tuxum taglikka vertikal havo kamerasi yuqoriga qaratilgan holatda o'rnatiladi va kesiladigan yuza yuqorida keltirilgandek yod va spirt bilan ishlov berib sterillanadi. 2. Plyonka, yopqich oyna yoki qalpoqcha olib tashlanib, steril qaychi yordamida po'stloq havo bo'shlig'i chegarasidan kesiladi. 3. Pintset yordamida po'stloq qobig'i olib tashlanadi. Ochilgan xorionallantois qobig'i bo'ylamasiga kesiladi. Hosil bo'lgan teshik orqali tuxumning ichki qismi kosachaga yoki lotokka quyib olinadi. 4. Po'stloq ichida qolgan xorionallantois pardasi pintset yordamida shilib olinib fiziologik eritmali steril kosachaga solinadi. Tekislanib, kosachani qora fonga qo'yib, hosil bo'lgan o'zgarishlar o'rganiladi. Xorionallantois qobig'idan virus saqlovchi material olish uchun uni qaychi bilan bo'laklanadi va tuzli eritma quyib, kvarts shishali xavonchada maydalanadi. Olingan suspenziya 10 – 15 minut davomida minutiga 2000 marta aylanish tezligida sentrifugalanadi, hosil bo'lgan cho'kma ustidagi suyuqlik virus saqlovchi material sifatida ishlatiladi (albatta, bakterial zararlanmaganiga ishonch hosil qilish uchun tekshirilishi zarur). Allantois bo'shlig'iga yuqtirish.Bu usul o'zining oddiyligi va yetarli miqdorda viruslarni yig'ilishi bilan qimmatlidir. Yuqtirish uchun odatda 10 – 11 kunlik embrion olinadi. Allantois bo'shlig'iga yuqtirishning asosiy bosqichlari: 1. Tuxum taglikka havo bo'shlig'ini yuqoriga qaratilgan holatda vertikal o'rnatiladi, to'mtoq uchi sterillanadi. 2. Preperatlash ignasi yordamida tuxumning to'mtoq uchi markazidan teshiladi. 3. Teshik orqali shprits ignasi kiritiladi. Igna vertikal holatda tutilib, havo bo'shlig'i,dan 2 – 3 ml pastroq kiritilib 0,1 – 0,2 ml miqdordagi material (masalan, gripp virusi) bo'shliqqa yuboriladi. 4. Tuxum po'chog'idagi teshikka eritilgan parafin quyilib yopiladi. Virus yuqtirilgan embrion 2 sutka davomida termostatda saqlanadi. Tuxumni ochishdan oldin bir kecha 40 Sli muzlatgichda saqlanadi. Tekshiruv uchun ochish bosqichlari quyidagicha: 1. Tuxum taglikka vertikal holatda o'rnatilib, po'stlog'i sterillanadi. 2. Havoli bo'shliq chegarasining yuqori qismidan qaychi yordamida po'stloq kesiladi. 3. Pintset yordamida po'stloq qobig'i extiyotkorlik bilan olib tashlanadi. So'ngra paster pipetkasi bilan xorionallantois pardasining qon tomiri kam bo'lgan joyidan teshiladi va allantois suyuqligi so'rib olinadi ( 5 – 6 ml suyuqlik olinadi). 4. Allantois suyuqligi steril probirkaga solinadi, bir qismi bul'onga bakterial sterillikni tekshirish maqsadida ekiladi. Allantois bo'shlig'iga yuqtirish usuli ko'pincha gripp, shuningdek, parotit va chechak virusini o'stirish maqsadida qo'llaniladi. Amnion bo'shlig'iga yuqtirish.Bu usul yuqoridakeltirilgan usullardan ancha qiyinligi va kam ishlatilishi bilan ajralib turadi. Bu usulning o'ziga xosligi shundaki, pnevmotrop viruslar yuqtirilganda bu virus nafaqat amnion bo'shlig'ida hujayralarida, balki embrionning o'pka to'qimasi va nafas yo'llarida xam ko'payadi. Yuqtirish maqsadida 7 – 12 kunlik embrion olinadi. Amnion bo'shlig'iga yuqtirish po'stloqda katta tuynuk hosil qilib ochiq usulda yoki tuxum po'chog'ini teshib yopiq usulda amalga oshirilishi mumkin. Birinchi usulda shikastlanish xavfi yuqori bo'lib, ikkinchi usul ishonchliroq, biroq bu usulda doim ham aniq amnion bo'shlig'iga tushib bo'lmaydi. Ochiq yuqtirish usuli texnikasi: 1. Tuxum taglikka qo'yilib, to'mtoq uchi sterillanadi. 2. Havoli bo'shliq ustidan po'stloqda qaychi yordamida 2 sm kattalikdagi darcha kesiladi. 3. Ehtiyotkorlik bilan pintset yordamida po'stloq pardasi olinib xorionallantois qobig'i ochiladi. 4. Qaychi bilan xorionallantois pardasi qon tomiri kam bo'lgan joyidan teshiladi va pintset kiritiladi. Pintset bilan amnion pardasi ushlanib amnion xaltasi xorionallantois pardasi ustiga tortib chiqariladi. 5. Amnion pardasini shu holatda ushlab turgan holda shpritsda 0,1–0,2 ml virusli material amnion bo'shlig'iga yuboriladi. 6. Po'stloqdagi teshik yopqich oyna yoki shisha qopqoqcha bilan yopilib, germetikligini ta'minlash uchun eritilgan parafin quyilib mustahkamlanadi. Virus yuqtirilgan embrion 2 sutka davomida inkubatsiyada saqlanadi (po'stloqdagi darcha orqali kuzatilib, 1-sutkada o'lganlari bo'lsa, chiqarib tashlanadi). So'ngra embrionlar bir kecha davomida muzlatgichda 40S haroratda saqlanadi. Amnion bo'shlig'iga virus yuqtirilgan embrionni ochish texnikasi: 1. Ochishdan oldin yuza sterillanadi, so'ngra tuxum po'chog'i havo bo'shlig'i chegarasidan biroz yuqoriroqdan kesiladi. 2. Xorionallantois pardasi paster pipetkasi bilan teshilib allantois suyuqligi olib tashlanadi. 3. Pintset yordamida amnion xaltasi tutilib shprits ignasi yoki paster pipetkasi bilan teshiladi va amnion suyuqligi so'rib olinadi. (0,5 mldan 1,5 ml gacha bo'lgan miqdorda). Virus yuqtirilgan embrion suyuqligi me'yordagi embrionning tiniq suyuqligidan farqli ravishda xiralashgan bo'ladi. 4. Olingan suyuqlik steril probirkaga solinadi. 0,1 – 0,3 ml miqdordagi suyuqlik bakterial sterillikni tekshirish maqsadida bulьonga ekiladi. Ba'zi hollarda amnion suyuqligidan tashqari tekshirish uchun amnion pardasi, traxeal suyuqlik va embrion o'pkasi ham olinadi. Gripp virusi bilan zararlanganda embrion o'pkasi rangining o'zgarishi alohida ahamiyatga egadir: bunda o'pka to'qimasi me'yoriy oqish – pushti rangdan to'q qizil rangga o'zgaradi. Foydalanilgan adabiyotlar ro'yxati 1. Borisov L.B., Smirnova A.M., Freydlin I.S., Shirobokov V.P. i dr. Meditsinskaya mikrobiologiya, virusologiya, immunologiya. Uchebnik. «Meditsina»- Moskva, 1994. 2. Bukrinskaya A.G. Virusologiya.- M. «Meditsina», 1986. 3. Birger M.O. Spravochnik po mikrobiologicheskim i virusologicheskim metodam issledovaniya. 3-e izdaniye – M. «Meditsina», 1982. 4. Boychenko M.N. Genetika bakteriy – uchebnoye posobiye. – M. MMA, 1996. 5. Volina Ye.G., Saruxanova L.E.Osnovы obщey mikrobiologii, immunologii i virusologii.- M. «Meditsina», 2004. 6. Vorobьyov A.A., Bыkov A.S. Atlas po meditsinskoy mikrobiologii, virusologii i immunologii.- M.MIA, 2003. 7. Vorobьev A.A. Meditsinskaya mikrobiologiya, virusologiya i immunologiya- uchebnik. M. MIA, 2004. 8. Golubeyev D.B. Rukovodstvo po primeneniyu kletochnыx kulьtur v virusologii. – L., 1986. 9. Goryachkina N.S., Radakova Ye.D., Kafarskaya L.I., Gladьko I.A., Klushina T.N. Obщaya meditsinskaya virusologiya.- Rostov-na- Donu «Feniks» Moskva, RGMU, 2007. Korolyuk A. M., Sboychakov V.B. Meditsinskaya mikrobiologiya– Uchebnoye posobiye- SPb. – ELBI-SPb, 2002.