VIRUSOLOGIYADA QO’LLANILADIGAN TADQIQOT USULLARI
Reja:
1.
Virus tutgan materiallarni qayta ishlash
2.
Elektron mikraskopiya metodi
Zamonaviy virusologiya – fanning mustaqil yo’nalishi
bo’lib, o’zining tekshirish usullari va maxsus masalalariga ega,
ularning yechimi virusologik laboratoriyalar va institutlarda
amalga oshiriladi.
Virusologik laboratoriyalarda ishlash qoidalari viruslarning
o’ziga xos xususiyatlarining mavjudligi va yuqori yuqumliligiga
asoslangandir. Shuning uchun ham bakteriologik va serologik
laboratoriyalarda zarur bo’lmagan bir qator sharoitlar virusologik
tekshirish usullarida talab qilinadi.
Virusologik laboratoriyalarda virus shtammlarini o’stirish va
ajratish, ularning identifikatsiyasi va turli xil ilmiy tekshiruvlarni
amalga oshirish kabi ishlar olib boriladi.
Viruslar bilan ishlaganda quyidagilar juda muhim:
1. Virus shtammlarining begona mikroflora bilan zararlanishiga
yo’l qo’ymaslik;
2. Ishlovchi xodimlarni virus bilan zararlanishdan himoyalash,
ayniqsa, aerozollar bilan ishlaganda ularning xavfsizligini
ta’minlash;
3. Atrofda yashovchi aholining xavfsizligini ta’minlash, ya’ni oqindi
suv, tajribaviy hayvonlarning o’ligi va boshqalar orqali virusli
infektsiya bilan zararlanishning oldini olish.
Shu asosiy talablarni hisobga olgan holda virusologik
laboratoriya tashkil etiladi va undagi ish tartibi belgilanadi.
Virusologik laboratoriya toza, yorug’ xonalarda, boshqa
laboratoriyalardan ajratilgan holda, yoki alohida binoda joylashishi
zarur. Bino virusologik tekshiruvlar uchun zarur bo’lgan jihozlar
bilan jihozlanadi. Virusologik laboratoriyada qanday ish
bajarilishidan qat’iy nazar tozalikni qat’iy saqlash lozim.
Odatda yirik virusologik laboratoriyalar viruslar bilan ishlash
uchun mo’ljallangan quyidagi maxsus bo’limlardan tuzilgan:
hujayra kulturalari tayyorlanadigan, in vitro va in vivo
(hayvonlarda va tovuq embrionida) serologik tekshiruvlar
o’tkaziladigan; viruslarni fizikaviy usullarda tekshiradigan
(elektronnoskopiya, ulьtrasentrifugalash va boshq.). Bundan
tashqari yuvish-avtoklav bloki, sog’lom va zararlangan hayvonlar
ishonchli ravishda alohidalangan vivariy, shuningdek, yordamchi
xonalar – sanitar nazoratdan o’tkazuv xonasi, dush, ventilyatsion
jihozlar uchun xona, chiqindilarni sterilizatsiya qilish xonalari ham
zarur.
Virusologik laboratoriya yoki institut qancha yirik bo’lsa,
shuncha ko’p maxsus bo’limlarga ega bo’ladi.
Viruslar va hujayra kulturalari bilan “toza” ishlarga
mo’ljallangan laboratoriya xonalari oynali to’siq bilan ajratilgan
boks oldi va boksdan tashkil topgan bo’lishi lozim. Boks oldi
xonasida maxsus bikslarda boksda ishlash uchun mo’ljallangan
steril xalat, qalpoq, maska, rezina qo’lqop va boshqalar saqlanadi.
Xavfli material bilan ishlaganda ko’pincha himoyalovchi
ko’zoynak, o’ta xavfli hollarda esa, respiratorlar yoki protivogazlar
taqiladi. Boks oldi xonasida sterillikni kamroq talab qiluvchi
yordamchi ishlarni ham o’tkazish mumkin. Asosiy virusologik
tekshiruvlar boksda o’tkaziladi. Boksdagi stol ishlovchilarni
zararlanishdan saqlash uchun himoyalovchi oyna bilan
ekranlashtirilgan bo’lishi kerak. Shu maqsadda ichki tomonida
bakteriotsid lampalar bo’lgan stollardan ham foydalaniladi.
Bokslar shunday jihozlanishi kerakki, devor, pol va shiftlarni
namlab tozalash mumkin bo’lsin. Bundan tashqari, ish
boshlashdan oldin va keyin bokslar bakteriotsid kvarts lampasi
bilan zararsizlantiriladi. Ish vaqtida boksga steril havo berish
tavsiya qilinadi. Yuqumli materiallar bilan ishlash yakunlangach
hamma chiqindilar qopqoqli metall idishlarga joylashtiriladi va shu
joyda dezinfektsion eritmalar bilan zararsizlantiriladi. Shundan
so’nggina idishlarni maxsus xonalarga yuboriladi va u yerda
chiqindilar qayta dezinfektsiyalanadi, avtoklavlanadi va qisman
yoqiladi. Bokslardan keluvchi havo maxsus filtrlar bilan
sterilizatsiyalanadi.
Virusologik laboratoriya xodimlari, ish vaqtida muloqotda
bo’lishi mumkin bo’lgan, barcha virusli infektsiyalarga qarshi
vaktsinatsiya qilinadi. Barcha xodimlar laboratoriyada ichki tartib
qoidalariga amal qilishi lozim.
O’ta xavfli viruslar va ularning tashuvchilari bilan ishlaydigan
laboratoriyalarga faqat Sog’liqni saqlash vazirligi maxsus
epidemiyaga qarshi boshqarmasining ruxsatnomasi bo’lgan
shaxslargagina ruxsat etiladi.
Virusologiyada qo’llaniladigan tekshiruv usullari
Bu usullarning murakkabligi, eng avvalo, viruslarning qat’iy
hujayra ichi parazitligi va ular o’lchamlarining kichikligi bilan
bog’liqdir.
Virusli infektsiyali bemorlardan olingan materiallarni laboratoriya
diagnostika qilish maqsadida turli xil tekshirish usullari
qo’llaniladi:
Elektron va yorug’lik mikroskopiya usuli;
Hujayra kulьturalarida viruslarni o’stirish va ajratib olish
(ularning tsitopatik ta’sirini, gemadsorbtsiya qilish xususiyatini va
viruslarning hujayraga ta’sirining boshqa ko’rinishlarini aniqlash)
usuli;
Rivojlanayotgan tovuq embrionida va sezgir tajriba hayvonlar
organizmida o’stirish va ajratib olish;
Gemagglyutinatsiya qilish xususiyatiga ko’ra viruslarni ajratish;
Turli xil serologik tekshirish usullari: an’anaviy serologik
reaksiyalar (komplementni bog’lash reaksiyasi, geldagi
pretsipitatsiya reaksiyasi va boshqalar) va ekspress-usullar; eng
ko’p ahamiyatga ega reaksiya – bu viruslarni neytralizatsiya
reaksiyasi hisoblanadi. Bu reaksiya viruslarni identifikatsiya qilish,
virus antigeni yoki antitelolarini aniqlash maqsadida turli xil
ob’ektlarda (hujayra kulьturalarida, tovuq embrionida, kamdan-
kam hollarda hayvonlarda) o’tkaziladi;
Molekulyar-genetik tekshirish usullari – molekulyar gibridizatsiya
va polimeraza zanjirli reaksiya.
Shunday qilib, virusologiyada ham maxsus virusologik
tekshiruv usullari, ham umum qabul qilingan mikrobiologik usullar
qo’llaniladi.
Quyida viruslar bilan ishlashning asosiy usullari keltirilgan.
Virusli infektsiyalarda tekshiriluvchi materiallar
Odamlar va hayvonlardan infektsion material olishda
viruslarning ma’lum to’qima va a’zolarga tropizmi, ularning atrof
muhitga tarqalish yo’llarini va virusli infektsiya patogenezining
o’ziga xosligini hisobga olish kerak. Bu omillar hisobga olinganda
infektsion material kerakli vaqtda va to’g’ri olinadi hamda
tekshiruvlar samarali bo’ladi.
To’qimali (a’zoli) tropizm – bu virus turining ma’lum
sezuvchan hujayralarda ko’paya olishi bo’lib, keyinchalik shu
to’qima va a’zolarda patologik jarayonning rivojlanishi, ya’ni Shu
virus bilan zararlanishi kuzatiladi.
Viruslarning to’qimali (a’zoli) tropizmi hujayralarda maxsus
retseptorlarning mavjudligi va virusning shu hujayralarda
reproduktsiyalanishi bilan aniqlanadi. Pnevmotrop, enterotrop,
gepatotrop, limfotrop, neyrotrop va dermotrop viruslar farqlanadi.
Tropizmga bog’liq holda tekshiruvda turli materiallar
qo’llaniladi. Masalan: pnevmotrop virus bo’lsa, halqumdan shilliq
va balg’am, enterotrop viruslarda najas, dermotrop viruslarda
vezikula yoki pustuladan suyuqlik olib tekshiriladi. Tropizmiga
ko’ra viruslar shartli ravishda bo’linadi. Hamma viruslar ham bu
sxemaga to’g’ri kelmaydi. Lekin shunga qaramay, viruslarni
tropizm xususiyatiga ko’ra ajratish amaliyot ishlarida qulay
hisoblanadi.
Virus tutuvchi materialni qayta ishlash
Olingan infektsion material aseptikaga rioya qilgan holda
steril idishga solinib, mustahkam yopiladi, muzli termosda
laboratoriyaga yuboriladi.
Viruslar tez inaktivatsiyaga uchraganligi uchun material
qisqa muddatda tekshirilishi lozim. Virusni saqlash uchun
tekshiralayotgan material (50% glitserin eritmasida) 5oC dan
yuqori bo’lmagan haroratda muzlatgichga qo’yiladi. Lekin eng
ishonchli usul -45o C va undan past haroratda muzlatilgan holda
saqlashdir; bunday sharoitda virus o’z hayot faoliyatini uzoq vaqt
saqlaydi.
Virus saqlovchi qattiq materialni qayta ishlash uchun uni
xavonchada ezish yoki maxsus apparat – gomogenezatorda
maydalash kerak. Keyin tuzli eritmada 10% li aralashma
tayyorlanib, 2000-3000 ayl/daq 15-30 daqiqa (yirik bo’laklar
cho’kmaga tushishi uchun) sentrifugalanadi. Viruslar cho’kma usti
suyuqligida qoladi va keyinchalik uni tekshirish davom ettiriladi.
Suyuq virus tutuvchi material sentrifugalanadi va xuddi
shunday cho’kma usti suyuqligi olinadi.
Begona mikrofloradan tozalash. Virus tutuvchi cho’kma
usti suyuqligining bakteriologik sterilligiga Shubha bo’lsa, begona
mikroorganizmlarni yo’qotish maqsadida unga antibiotiklar
qo’shiladi. Antibiotiklar viruslarga ta’sir qilmaydi va ular o’z hayot
faoliyatini saqlab qoladi. Penitsillin, streptomitsin (200-1000
TB/ml) va nistatin (20 TB/ml) qo’llaniladi. Hozirgi vaqtda
antibiotiklarga chidamli shtammlarning ko’p tarqalganligi sababli
keng ta’sir doirali antibiotiklarni yoki ularning birikmalarini
(masalan: tetratsiklin, oksatsillin, gentamitsin va boshqalar)
qo’llash ma’qulroqdir. Qoida bo’yicha 30-60 daqiqalik aloqa
bakteritsid ta’sir uchun yetarli bo’ladi, lekin shunda ham material
bakteriologik sterillikni nazorat qilish uchun oziq muhitga ekilishi
zarur. Begona mikrofloradan holi bo’lgan virus saqlovchi
suyuqlikdan keyingi tekshiruvlarda foydalaniladi.
Viruslar kontsentratsiyasi. Agar tekshiriluvchi materialda
virusning kam miqdorda ekanligi taxmin qilinsa, ikki marta
sentrifugalanadi: oldin 2000-3000 ayl/daq da 20 daqiqa davomida
yirik bo’laklar cho’ktiriladi, so’ngra virus saqlovchi cho’kma usti
suyuqligini 40000 ayl/daq da bir soat mobaynida
ulьtrasentrifugalanadi va viruslar to’plangan jelesimon cho’kma
olinadi.
Virusli infektsiyasi bor bemorlardan tekshiruv materiallarini
olish va qayta ishlashga doir misollar:
Burun halqum yuvindisi. Bemor 10 ml hajmdagi steril fiziologik
eritma yoki Xenks eritmasi bilan og’zini chayadi (ertalab
ovqatlanish va dori ichishdan oldin). Yuvindini flakonga solib, muz
solingan termosda laboratoriyaga yuboriladi. Keyinchalik chayindi
2000 ayl/daq da 15 daqiqa sentrifugalanadi, olingan cho’kmaga
usti suyuqligiga antibiotiklar qo’shiladi va 30-60 daqiqadan so’ng
material keyingi tekshiruvlarga tayyor bo’ladi.
2-5 g miqdordagi bemor axlatini flakonga solib, rezina probka
bilan yopiladi va muzli termosda laboratoriyaga yuboriladi.
Laboratoriyada Xenks eritmasi bilan material 1:10 nisbatda
suyultiriladi, shisha bankani silkitish yo’li bilan gomogenizatsiya
qilinadi, keyin 30 daqiqa davomida 2000-3000 ayl/daq da
sentrifugalanadi.
Cho’kma
usti
suyuqligiga
kerakli
kontsentratsiyada antibiotiklar qo’shiladi. 30-60 daqiqali
kontaktdan so’ng sterillikning bakteriologik nazorati uchun
bulonga ekiladi.
Javob olinguncha cho’kma usti suyuqligi muzlatilgan holatda
saqlanadi, keyinchalik undan virusni ajratib olishda foydalaniladi.
Viruslarni tozalash usullari
Ba’zi virusologik tekshiruvlarni o’tkazish uchun, masalan,
elektronnomikroskopik, shuningdek viruslarning fizik-kimyoviy
xususiyatlarini o’rganish uchun begona aralashmalarsiz, o’ta
tozalangan preparatlar kerak bo’ladi. Ikki marta sentrifugalash
yo’li bilan kontsentrlangan virus tutuvchi materiallar Shunday
tozalanishi zarurdir. Qo’shimcha tozalash ishlari fizik-kimyoviy
usullar bilan amalga oshiriladi.
Differentsial sentrifugalash. Cho’kish tezligiga ko’ra turli
kattalikdagi bo’laklarni ajratish usuli. Bu usulda virus tutuvchi
material ko’p marotaba kichik (2000-3000 ayl/daq) va katta
(40000-50000 ayl/daq) tezliklarda sentrifugalanadi. Virus bir
cho’kma usti suyuqligida (kichik tezlikda), bir cho’kmada (katta
tezliklarda) bo’ladi, resuspenziyalanib, yana sentrifugalanadi. Bu
yo’l bilan virusning yuqori darajada tozalanishiga erishiladi.
Zichlik gradientida sentrifugalash. Viruslarni tozalash va
ularning zichligini aniqlash uchun qo’llaniladi.
Bu usulda tsentrifuga probirkasiga moddaning har xil
zichlikdagi eritmalari qavat-qavat qilib quyiladi (masalan,
saxaroza), bunda eng yuqori zichlik (virus zichligidan yuqori)
probirka tubida hosil qilinadi, yuza qismiga qarab esa, zichlik asta-
sekin kamayib boradi. Tozalanuvchi virus tutuvchi aralashma
yuqori qismga quyiladi. Sentrifugalash vaqtida har xil zichlikdagi
bo’laklar eritmaning turli qatlamlarida alohida zona sifatida
taqsimlanadi. Ma’lum zichlikka ega bo’lgan viruslar, to’qima
bo’laklari zichligidan farq qilib, qaysidir bir zonada joylashadi va
ularni toza holda ajratib olish ham mumkin.
Virus tutuvchi suyuqlikni kolonkalar orqali filtrlash,
sefadeks bilan to’ldirish (dekstranli gel). Bu kolonkalarning ajratish
xususiyati shunga asoslangan-ki, har hil kattalikdagi bo’laklar
undan turlicha tezlikda o’tadi, ya’ni yiriklari maydalariga nisbatan
tezroq o’tadi. Filtratning alohida portsiyalarini yig’ib, ularning
biridan tozalangan virus olinadi.
Viruslarning turli adsorbentlarga adsorbtsiyalanishi
va elyutsiyasi.
Ma’lum sharoitlarni tanlab olib, virus ba’zi moddalarga sorbtsiya
qilinadi (smola, bentionit, gips va boshqalar), keyin esa ularni
ajratib olish (elyutsiya) mumkin, bunda adsorbentda qoldiq,
eritmada esa tozalangan virus bo’ladi.
Tozalash usullarining boshqalari ham qo’llaniladi, masalan,
viruslarni alkogol ta’sirida cho’ktirish va boshq.
Agar virusni yana tozalash kerak bo’lsa, yoki ularning
komponentlarni o’rganish zarur bo’lsa, ularni fraktsiyalarga
ajratish usullari qo’llaniladi. Ya’ni o’rganilayotgan virus preparati
bir necha fraktsiya (bo’lak) larga bo’linadi va har biri alohida
tekshiriladi. Fraktsiyalashda elektroforez, xromatografiya, ion
almashinuvchi smolalar ishlatiladi.
Ulьtrafiltrlash. Uzoq vaqt davomida ultrafiltrlash usuli virus
saqlovchi materialni boshqa mikroorganizmlardan va begona
qismlardan tozalash usullarining asosiysi bo’lib kelgan. Bu filtrlar
har xil turda (keramikali yoki “shamchali”, asbestli va
membranali) bo’lib, maxsus mayda teshiklardan tuzilgan. Biroq,
hozirda virus saqlovchi materialni tozalashda bu usul deyarli
qo’llanilmaydi, chunki adsorbtsiya natijasida filtrlarda juda ko’p
viruslar qolib ketadi, Shuningdek ularning teshiklari filtrlangan
bo’laklar bilan to’lib qoladi va bu usul ancha mehnat talab qiladi.
Ulьtrafiltratsiya usuli virusologiyada, asosan, yuqori
haroratga chidamsiz oziq muhitlar, turli eritmalar, zardob va
boshqa suyuqliklarni “sovuk” sterilizatsiyasida qo’llaniladi. Bir
narsani esdan chiqarmaslik kerakki, sterilizatsiyaning bu usuli
to’liq ishonchli emas, chunki ultrafiltrlar mayda o’lchamli
ob’ektlarni ham o’tkazib yuboradi (viruslar, L-shaklli donador
elementlar, mikoplazma va boshq.).
Virusologiyada qo’llaniladigan mikroskopik tekshirish
usullari
1. Elektron mikroskopiya.
Elektron mikroskopning
qo’llanilishi viruslar morfologiyasi va ultrastrukturasi haqidagi
bilimlarimizni yetarli darajada oshirdi, viruslar va hujayraning
o’zaro ta’sirini, viruslarning reproduktsiya jarayonidagi
morfogenez bosqichlarini o’rganishga imkon berdi. Virusli
infektsiyalarni diagnostika qilishda elektronnoskopiya va, ayniqsa,
immunoelektronnoskopiyalar qo’llaniladi.
Elektronnoskopik preparatlar.
Ular tozalangan va
kontsentrlangan virus saqlovchi aralashmalardan yoki virus bilan
zararlangan to’qimaning ulьtrayupqa kesmasidan tayyorlanadi.
Virusli ob’ektlar maxsus plyonkaga qo’yiladi. Bu plyonkalar juda
yupqa (qalinligi 30 nm dan oshmasligi), tiniq va mustahkam
bo’lishi kerak. Kolloid-ko’mirli plyonkalar eng yaxshi plyonka
hisoblanadi. Plyonkalarni ko’p sonli teshiklarga ega bo’lgan,
misdan tayyorlangan ushlab turuvchi (diametri 2-3 mm) to’rga
joylashtiriladi. Keyinchalik preparatlar quyida keltirilgan turli
usullar bilan qayta ishlanadi.
Metallar bilan changlantirish
usuli (soyali qayta
ishlash). Kontrast preparatlarni olishda qo’llaniladi. Vakuum
sharoit va yuqori xaroratda maxsus moslamada hosil bo’luvchi
og’ir metall (oltin, platina, uran va boshqalar) bug’lari o’tkir
